Esta prueba puede realizarse ajustándose a las especificaciones de la norma ISO 7346-1 o la guía OECD 203.Ambas directrices evalúan el efecto tóxico de una sustancia para peces. Para ello se emplean ejemplares de la especie Brachidario rerio (pez cebra), que se exponen a diferentes concentraciones de la sustancia de ensayo durante 96 horas, registrándose la mortalidad a las 24, 48, 72 y 96 horas. Además, durante la exposición debe medirse diariamente el oxígeno disuelto, el pH la salinidad la dureza y la temperatura del agua.
De acuerdo con la norma ISO 7346-1, la prueba se realiza en dos fases, 1) una prueba preliminar, para determinar el rango de concentraciones a emplear posteriormente en la prueba definitiva, empleando una serie geométrica de 5 concentraciones (por ejemplo 1000 mg/L, 100 mg/L, 10 mg/L, 1 mg/L y 0,1 mg/L) y tres peces por concentración de ensayo, y 2) una prueba definitiva, que se realiza exponiendo 7 peces a un mínimo de cinco concentraciones en serie geométrica, preferiblemente con un factor que no supere el 2,2 (preferiblemente 1,6 o 1,8). Con los resultados de la prueba, se calcula la dosis letal 50, la concentración que causa la mortalidad del 50% de los individuos de ensayo. (LD50: Lethal dose 50%). Para ello, se deben incluir entre las concentraciones de ensayo, la concentración más baja que causa una mortalidad del 100% y la concentración más alta no letal determinadas en la prueba preliminar. Las pruebas incluyen también un control positivo y negativo.
La Guía OECD 203, establece que, si el cliente posee información previa sobre la toxicidad de la sustancia, y conoce el rango de concentraciones en el que se encuentra la LD50, puede realizar directamente la prueba definitiva seleccionando las 5 concentraciones de ensayo, ya que no es obligatorio determinar la máxima concentración letal y la mínima no letal en una prueba preliminar. Sin embargo, si se desconoce la toxicidad de la sustancia de prueba y el rango de concentraciones a seleccionar, puede solicitar la realización de la prueba preliminar.
Ambas regulaciones recogen también la posibilidad de realizar una prueba límite, para sustancias que se espera que no muestren toxicidad, que debe realizarse exponiendo 10 peces a una única concentración de ensayo (100 mg/L o el límite de solubilidad de la sustancia de ensayo en las condiciones de prueba) y a los controles de la prueba.
Para solicitar la prueba, el cliente debe indicar: la directriz que se desea seguir, la prueba a seleccionar (prueba definitiva, preliminar y definitiva o prueba límite), la concentración o concentraciones de ensayo (expresadas en mg de producto/L), la naturaleza y solubilidad en agua de la sustancia de prueba. Las sustancias a probar se disuelven en el agua de dilución. Debe evitarse el uso de otros solventes diferentes al agua. En caso de que deban emplearse otros solventes, deben incluirse un control de la toxicidad del solvente.