Clostridium botulinum: Detección de anticuerpos anti-toxina botulínica en suero o plasma, mediante prueba de referencia de neutralización en ratones.
El método de referencia aceptado para detectar y cuantificar los anticuerpos frente a la toxina botulínica es la prueba de neutralización en ratón (Mouse Neutralization Assay), en el que una solución de la toxina botulínica, cuantificada en Dosis Letal 50% para el ratón (DL50), se mezcla con varias diluciones en base 2 ó en base 4 del suero/plasma problema, y tras una incubación se inocula por vía intraperitoneal a unos lotes de ratones. La dilución más elevada del suero problema que reduzca la toxicidad es el título de anticuerpos frente a la correspondiente toxina botulínica del suero. Esta dilución, comparada con un standard internacional permite obtener los resultados en unidades internaciones (UI/mL) (1 U.I. se define como la cantidad de anticuerpos que neutraliza 10.000 DL50 de toxinas A o B, o 1.000 DL50 del tipo E). La cantidad de toxina utilizada en las pruebas es aquella que es neutralizada por 0,02; 0,005 y 0,0125 UI/mL de antitoxina para los tipos A, B y E, respectivamente. Los sueros que no protegen al ratón al título de 1:4 se informan como <0,02 UI/mL para el tipo A, o <0,005 UI/mL para el tipo B. Esta prueba es laboriosa, costosa y de larga duración de realización, por lo que se han buscado alternativas basadas en métodos de enzimoinmunoanálisis (ELISA) utilizando microplacas recubiertas de toxina botulínica. Sin embargo, los valores obtenidos por ELISA, a veces, no se correlacionan completamente con la prueba de neutralización en ratón.
Como paso previo a la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis mínima mortal (d.m.m.) de toxina. El cálculo de la dosis mínima mortal se realiza diluyendo en base 10 el filtrado de un cultivo, diluyendo a la mitad con solución salina fisiológica para obtener la misma dilución que la toxina mezclada con suero o plasma de paciente, e inoculando con cada mezcla de dilución unos animales de laboratorio. De esta forma se calcula la dilución máxima (la más elevada) que provoca la muerte de los animales inoculados. El volumen inoculado que ha provocado la muerte de los animales contendrá una dosis mínima mortal. Los animales son inoculados con la dosis mínima mortal (d.m.m.) de toxina diluida junto con el suero/plasma del paciente (v:v) puro y con diluciones en base 10.
En el informe se indica sobre la presencia o ausencia de anticuerpos específicos por prueba de neutralización frente a la dosis mínima mortal en ratones de la toxina utilizada.