Detección e identificación de especies animales en alimentos cárnicos o piensos mediante métodos moleculares (PCR y secuenciación)

 

Información 05-07-18.

 

La búsqueda de métodos analíticos más exactos y sensibles, para determinar la presencia de derivados de algunas especies animales en productos destinados a la alimentación humana y animal, se ha incrementado de forma importante en los últimos años. Esta tendencia se justifica por diversos intereses, entre los que cabe destacar los económicos, éticos y de salud pública.

La sustitución fraudulenta de especies de alto valor económico por otras de menor coste, la fabricación de productos con menor cantidad de especie que la declarada, la inclusión de carne en productos destinados a vegetarianos, la presencia de especies no permitidas para algunos grupos religiosos (ganado porcino para mulsumanes) o de determinado sexo (hembras de vacuno para hindúes), así como el riesgo de salud asociado a comida no apta para el consumo ha impulsado el establecimiento de mayores controles en la cadena de producción y comercialización de productos para la alimentación. La legislación europea actual requiere de la aplicación de sistemas que permitan trazar documentalmente el origen de los productos comercializados, además de aumentar el número de ensayos estandarizados para el análisis de alimentos. La presencia de alguna de las especies animales está regulada por estas normativas con el fin de evitar el riesgo de transmisión de algunas enfermedades como la encefalopatía espongiforme bovina (enfermedad de las vacas locas), asociada a la nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob enfermedad neurodegenerativa humana, el scrapie de los corderos, o la encefalopatía espongiforme felina de los gatos.

Los sistemas actuales de identificación y detección de especies animales en productos para la alimentación se pueden agrupar en tres categorías atendiendo al tipo de molécula que analizan: a) los basados en el análisis de proteínas animales, incluyendo los denominados alimentos de carne y hueso (MBM: Meat and bone meal); b) los basados en la tecnología de ácidos nucleicos (ADN); y c) otros sistemas que utilizan información independiente de ADN y proteína. Entre los métodos más considerados se encuentran:

a) Sistemas basados en proteínas:

El ensayo de Enzimoinmunoanálisis- ELISA- capaz de detectar la presencia de proteínas de varias especies mediante una reacción específica entre un antígeno y su correspondiente anticuerpo, son los métodos de identificación proteica de especies más utilizados y adecuados para aplicaciones de laboratorios de análisis y control de calidad. Estos análisis permiten, además, la cuantificación de proteína comparando los patrones con cantidades conocidas de la proteína diana. La inmunodetección ha encontrado aplicación sobre todo en la detección de especies de mamíferos y aves (bovino, oveja/cabra, pollo), y en particular en la industria láctea.

Por su sencillez y rapidez, el inmunoensayo es el método más utilizado para el análisis de especies proteicas en alimentos. Sin embargo adolece de algunas limitaciones importantes:

  • La especificidad de los anticuerpos no siempre permite diferenciar entre especies muy próximas filogenéticamente.
  • La especificidad de las regiones antigénicas es menor cuanto mayor sea el parentesco filogénico. Al obtener anticuerpos frente a una proteína que actúa como antígeno, esos anticuerpos reaccionarán positivamente al ponerse en contacto con esa proteína, pero también darán reacciones positivas al ponerlos en contacto con proteínas de otros especies filogenéticamente próximas.
  • La identificación depende de la disponibilidad de anticuerpos específicos para esa especie.
  • La detección depende de la conservación de la estructura del antígeno. Esta es una limitación importante puesto que en alimentos procesados, sometidos frecuentemente a etapas de esterilización por calor, las proteínas pueden perder la conformación requerida para la unión del anticuerpo. Por lo tanto, para que sea efectivo con productos cárnicos procesados, enlatados, etc., es necesaria la selección de péptidos resistentes a la desnaturalización por calor. En la actualidad existen varios kits comerciales que permiten la identificación inmunológica de las especies más comunes de la industria cárnica y láctea, con sistemas capaces de funcionar incluso con muestras calentadas a 100ºC, pero no con muestras calentadas a temperaturas superiores.

b) Sistemas basados en el análisis de ácidos nucleicos (ADN):

Las técnicas genéticas de identificación están basadas en la detección de secuencias de ADN únicas para cada especie. La molécula de ADN ofrece una serie de ventajas cuando se compara con los marcadores proteicos. En primer lugar, la información genética que contienen los tipos celulares de un individuo es idéntica y por tanto la identificación es independiente del tejido. En cambio, las proteínas son el resultado de la expresión génica, que puede ser distinta según el tejido, la etapa del desarrollo, el ambiente e incluso de la época del año. Otra ventaja deriva de la degeneración del código genético, por la existencia de más codones que aminoácidos. El que un determinado aminoácido pueda estar codificado por más de un triplete, otorga al ADN un carácter más informativo debido a su mayor variabilidad.

Otra de las características del ADN es su estabilidad a altas temperaturas. En los procesos de elaboración de conservas en los que se alcanzan elevadas presiones y temperaturas, las proteínas se desnaturalizan y se degradan mientras que el ADN sufre fragmentación, reduciéndose hasta un tamaño medio de 100 a 200 pb. Aunque la molécula de ADN se fragmenta debido a estos procesos, la información de la secuencia de los fragmentos sigue siendo útil para la identificación, siempre que éstos tengan la longitud suficiente para ser analizado.           

Los sistemas de identificación de especies en alimentos basados en ADN utilizan la amplificación mediante PCR, ya que permite detectar cantidades muy pequeñas de ADN a partir de los materiales más diversos. En general se considera que, en una misma muestra procesada, las proteínas pierden antes su capacidad de identificación por métodos inmunológicos que el ADN su viabilidad para ser amplificado por PCR. Otra de las ventajas importantes del uso de ADN, es que los datos de secuencia pueden analizarse atendiendo a distintos niveles de especificidad desde grupos o especies hasta incluso variantes o modificaciones genéticas de individuo.

Actualmente, debido al mayor conocimiento del genoma de muchos organismos y la a disponibilidad de mejoras en los métodos de amplificación, los sistemas de detección e identificación basados en ADN han tenido un desarrollo importante, complementado o sustituyendo en algunos casos las técnicas basadas en proteínas. Todas las técnicas basadas en ADN tienen ventajas e inconvenientes particulares dependiendo de las características del análisis. Entre las cualidades de estos sistemas, se ha demostrado que los métodos basados en ADN consiguen la detección con gran precisión y poder de resolución. Entre las desventajas se encuentra su coste económico y la relativa facilidad de contaminación de las muestras, de forma que ADN contaminante puede ser amplificado fácilmente dando lugar a falsos positivos. Igualmente, posibles contaminaciones con ADNasas pueden afectar a los resultados. Otra posible desventaja es su sensibilidad ya que depende de la diana que se elija para amplificar, aumentando cuando se elige una diana que sea abundante en las células.

Los genes mitocondriales son idóneos para la identificación de especies siendo los más utilizados para estudios de filogenia; los genes mitocondriales cytB y COXI ya que disponen de regiones conservadas, sobre las que se pueden diseñar cebadores “universales” que pueden usarse para la amplificación de un amplio número de especies, y regiones variables, lo que permite la identificación a nivel de especie por secuencia, y el diseño de cebadores para la amplificación específica de especies. Sin embargo, en el caso de la identificación de variedades, orígenes geográficos o de individuos, resultan más apropiados por su mayor variabilidad la región de control D-loop del ADNA mitocondrial o secuencias de ADN nuclear tales como microsatélites o polimorfismos en genes asociados a alguna característica diferenciadora de la variedad o raza. También han sido utilizados los genes 12S rRNA y 16S rRNA con frecuencia para identificación de especies.

Sin embargo, a pesar de que la tasa de mutación del ADN mitocondrial de los animales es superior a la del ADN nuclear. Una alternativa al ADN mitocondrial es el uso de regiones de ADN nuclear que contienen secuencias repetidas, generalmente procedentes de retrotransposones, SINES y LINES (short y long interspersed nuclear elements), los cuales se encuentran en grandes cantidades en el ADN nuclear de eucariotas y conjugan un elevado número de copias. Estas características los hacen útiles para detectar pequeñas cantidades de ADN por PCR, y debido a su localización nuclear, se evita la variabilidad asociada al número de mitocondrias por célula dependiente de tejido.           

c) Otros métodos:

Además de las técnicas basadas en proteínas y en ADN también se han desarrollado otras tecnologías como son, entre otras, la microscopía clásica y la microscopía de infrarrojos:

La Microscopía clásica: es el método internacionalmente utilizado, con un límite de detección menor al 0,1%, capaz de discriminar los materiales prohibidos de los permitidos. Útil además, para detectar derivados cárnicos y de hueso (MBM), al permitir diferenciarlos de los correspondientes a pescados. Con experiencia, algunos llegan a diferenciar carnes de mamíferos, respecto a las de aves. Sin embargo, este método presenta dificultades para identificar el origen animal específico de las partículas detectadas y se requiere de gran experiencia para diferenciar entre partículas cárnicas de mamíferos respecto a las de las aves o pescados, y la mayoría de laboratorios no pueden diferenciar entre mamíferos y aves, y menos aún entre distintas especies de mamífero como bovinos, ovinos o porcinos. A pesar de ello, es un método robusto, rápido y capaz de detectar contaminaciones del 0,01%.

La Microscopía de infrarrojos (NIR: Near Infrared microscopy): mide el espectro de emisión de las partículas individuales en las muestras y con ello determina el grupo de animales a los que corresponde. Esta técnica presenta la ventaja de ser objetiva, sensible y selectiva para detectar variaciones estructurales significativas causadas por la incorporación a la especie de un ADN exógeno. Sin embargo, no permite detectar pequeños cambios en el ADN o en una proteína y hasta el momento solo puede dar una indicación del origen de las partículas detectadas. La principal ventaja con respecto a la microscopía clásica es que puede ser automatizada y no requiere experiencia del analista. En combinación con otras técnicas puede lograr la identificación específica del material.

Pruebas realizadas en IVAMI:

  • Identificación molecular de determinadas especies animales en productos cárnicos, piensos y alimentos conservados mediante amplificación por PCR (reacción de la cadena de la polimerasa) de los genes mitocondriales cytB, COXI, 12S rRNA y 16S rRNA.

Muestra recomendada:

  • Producto cárnico, pienso y/o alimentos conservados.

Conservación y envío de la muestra:

  • Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días (solo para pruebas de diagnóstico molecular).

Plazo de entrega de resultados:

  • Identificación molecular de especies animales en productos cárnicos, piensos y/o alimentos conservados: 3 a 5 días.

Coste de la prueba:  

  • Identificación molecular de especies animales en productos cárnicos, piensos y/o alimentos conservados: Consultar a ivami@ivami.com