Clostridium botulinum – Botulismo (Formas clínicas). Pruebas para diagnóstico de botulismo. Detección de toxina en pacientes, alimentos, piensos, lodos o sedimentos acuáticos; aves acuáticas, otras muestras. Pruebas recomendadas: detección de toxina,  Cultivo de C. botulinum, Tipado de toxina botulínica; Diagnóstico molecular (PCR).

 

Información 05-08-16.

 

Características de Clostridium botulinum y de la/s toxina/s botulínica/s

 

Clostridium botulinum es un bacilo anaeróbico estricto, grampositivo, del género Clostridium, familia Clostridiaceae, formador de esporas que produce una toxina neurotóxica. Esta bacteria suele encontrarse en la tierra y en aguas y sus sedimentos no tratados (océanos, lagos), con una distribución mundial. En algunas circunstancias este organismo puede contaminar alimentos y crecer en ellos produciendo su toxina/s. El botulismo, una forma grave de envenenamiento por alimentos, resulta de la infección de alimentos conteniendo la toxina. Aunque esta enfermedad por alimentos es rara, su tasa de mortalidad es elevada. Cuando se determinó el tipo de toxina entre los 1036 casos detectados en EE.UU. entre 1899 y 1990, 384 fueron por toxina tipo A, 106 por toxina B, 105 por toxina E y 3 por toxina F. A veces pueden darse casos debidos a 2 toxinas, por ejemplo A y B.

Todas las formas de botulismo humano o animal, son debidas a la absorción de la toxina botulínica formada durante la multiplicación de la bacteria Clostridium botulinum.   La toxina posee una toxicidad (neurotoxicidad) muy elevada, por lo que ejerce su acción en dosis ínfimas, es termolábil, mientras que las esporas de esta bacteria son termorresistentes y sobreviven en los alimentos calentados a más de 100ºC, como las conservas sometidas a tratamientos térmicos. Además de C. botulinum algunas cepas de C. butyricum, C. baratii y C. argentinense pueden producir la neurotoxina botulínica.

Existen 7 tipos de toxina (A – G) diferenciables por pruebas de neutralización, útiles para la clínica y para epidemiología. Los tipos A, B, E y F son las principales causas de botulismo humano, mientras que los tipos C y D se encuentran en el botulismo animal, siendo los más afectados las aves silvestres y las aves de corral, el ganado vacuno, el ganado equino y algunas especies de pescados. Los tipos A y B son los más frecuentes en hombre, y se encuentran principalmente en alimentos relacionados con  la contaminación de conservas vegetales de preparación casera, pero en Europa estos tipos también se han encontrado en relación con alimentos cárnicos. El tipo E (piscícola) se encuentra en medios acuáticos y se correlaciona con los casos de botulismo E en relación con pescados contaminados o mariscos, y está aumentando. El tipo F es excepcional. El tipo C se ha subdividido en C1 (neurotoxina) y C2 (no es neurotoxina, afecta la permeabilidad vascular y es enterotoxigénica). El tipo G es producido por C. argentiniense (aislados del suelo en Argentina, del suero de pacientes fallecidos, aunque no está clara su implicación).

Las toxinas se sintetizan durante el crecimiento de la bacteria, como una proteína inactiva (150 kDa), que se libera de la bacteria al lisarse. Para activarse, la toxina formada  debe degradarse en dos cadenas polipeptídicas (50 y 100 kDa).           

C. botulinum, puede diferenciarse en grupos según sus características de cultivo, bioquímicas y fisiológicas. Todos los cultivos de tipo A y algunos del tipo B y F son proteolíticos. Los cultivos de C. botulinum que producen las toxinas C y D no son proteolíticos, cuando se cultivan en un medio con clara de huevo coagulada o carne. Todos los de tipo E y algunos de los del tipo B y F son no-proteolíticos, pero poseen características del metabolismo de los carbohidratos que los diferencian de los grupos no-proteolítcos de los tipos C y D. Las cepas de tipo G no han sido estudiadas con suficiente detalle para una caracterización efectiva y satisfactoria.

La temperatura óptima de crecimiento y producción de toxina está alrededor de 35ºC para las cepas proteolíticas; para las cepas no-proteolíticas es de 26-28ºC. Las cepas no-proteolíticas de los tipos B, E y F pueden producir toxina a temperaturas de refrigeración (3-4ºC). Las toxinas de las cepas no-proteolíticas no manifiestan su máxima toxicidad hasta que se ha activado la toxina con tripsina. Las toxinas de las cepas proteolíticas generalmente se producen en su forma activada.

Formas clínicas de botulismo

Existen cuatro formas clínicas de botulismo humano:

• Toxiinfección alimentaria (botulismo alimentario), debida a la ingestión de un alimento contaminado con Clostridium botulinum en el que se encuentra la toxina preformada.

• Botulismo de heridas, producido por la infección de heridas con Clostridium botulinum y la elaboración de toxina in vivo después de crecer la bacteria en la herida.

• Botulismo infantil, producido por la elaboración de toxina en el tubo digestivo de los niños pequeños colonizados por Clostridium botulinum (la causa más frecuente se debe a la ingestión de miel contaminada o jarabe de maíz), seguida de la absorción de la toxina. Estos pacientes pueden tener anticuerpos frente a la toxina.

• Botulismo intestinal del adulto, producido por la colonización digestiva en adultos mayores por Clostridium botulinum, seguida de la absorción de la toxina. Estos pacientes pueden tener anticuerpos frente a la toxina.

En cualquiera de las formas clínicas de botulismo humano, e igual en el botulismo animal, la toxina penetra en la sangre desde el tubo digestivo cuando se ha ingerido preformada con un alimento, o cuando se ha producido por la bacteria que coloniza el tubo digestivo (niños pequeños o adultos), o en casos excepcionales desde una herida infectada por la bacteria. Hay algunos alimentos que son más propensos que otros a contener toxina botulínica. Los alimentos con pH inferior a 4,5 es más difícil que sean causa de botulismo ya que a este pH C. botulinum es incapaz de multiplicarse y elaborar la toxina (este es el caso de los zumos de frutas, alimentos marinados en vinagre, etc.). Por el contrario los alimentos con pH igual o superior a 4,5 pueden causar botulismo, ya que en ellos es posible la multiplicación y producción de toxina (este es el caso de carnes, pescados, legumbres, platos preparados, etc.), sobre todo aquellos alimentos exentos de exposición al oxígeno, como ocurre con los alimentos enlatados o envasados al vacío, y que tengan un pH mayor de 4,6. Son ejemplo de alimentos peligrosos: jamón curado o ahumado, conservas de pescado o vegetales (sometidas a un tratamiento térmico insuficiente para destruir las esporas), etc. Las latas de conservas contaminadas con C. botulinum suelen estar abombadas, aunque esto no suele ocurrir con el tipo E.

La toxina absorbida se fija irreversiblemente a las uniones neuromusculares de las neuronas motoras, impidiendo la liberación de acetilcolina, y provocando la parálisis fláccida o la atonía muscular.

La clínica se caracteriza por una parálisis aguda fláccida, que suele comenzar con afectación bilateral de los pares craneales, afectándose los músculos de la cara, cabeza y faringe, y luego desciende simétricamente para afectar a los músculos del tórax y de las extremidades. La muerte, cuando ocurre, es debida al fracaso respiratorio por la parálisis de la lengua y músculos faríngeos que ocluyen las vías aéreas superiores, o bien por parálisis del diafragma y de los músculos intercostales. Por esta razón, los pacientes deben recibir antitoxina botulínica y los cuidados intensivos respiratorios necesarios.

Pruebas de laboratorio disponibles

Detección de la toxina botulínica en las muestras/productos sin cultivo previo (para muestras recomendadas ver después en el apartado de pruebas ofertadas por IVAMI  y muestras requeridas).

Esta es la prueba recomendada en un paciente con clínica de botulismo.

La detección de la toxina botulínica preformada puede llevarse a cabo en un líquido como el suero obtenido a partir de sangre. También puede detectarse a partir de los restos de un alimento ingerido que haya causado un caso/brote de botulismo, preparando un extracto filtrado a partir de él. En los casos de botulismo infantil o de botulismo intestinal puede detectarse la presencia de toxina botulínica en las heces de los niños/pacientes, pero consideramos más recomendable realizar un cultivo previo de las heces (ver después). Para detectar la toxina se lleva a cabo la inoculación de animales de experimentación (ratones) que desarrollarán una sintomatología paralítica, seguida de muerte, si se les inoculó toxina botulínica. Para corroborar que los ratones han muerto por la inoculación de toxina botulínica, es necesario realizar una prueba de neutralización, que permite confirmar que existe toxina botulínica y al mismo tiempo permite identificar el tipo de toxina botulínica presente. Esta prueba de neutralización se realiza enfrentando el producto inoculado (suero de persona o animal, extracto de alimento ingerido, …) a antisueros específicos de cada tipo de toxina.

Como paso previo a la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis mínima mortal (d.m.m.). De esta forma calcularemos la dilución máxima (la más elevada) que provoca la muerte de los animales inoculados, y el volumen inoculado que ha provocado la muerte de los animales contendrá una dosis mínima mortal.

Para identificar el tipo de toxina, una vez titulada y conocida la “dosis mínima mortal”, se realizará el enfrentamiento de una dosis mínima mortal con los distintos tipos de sueros anti-botulínicos. Estas mezclas serán inoculadas en igual volumen a los animales de experimentación y aquellos que sobrevivan, habrán sido inoculados con la mezcla de “dosis mínima mortal” más un antisuero frente a un tipo que ha sido capaz de neutralizarlo.

Detección de la toxina en las muestras/productos tras cultivo previo (para muestras recomendadas ver después en el apartado de pruebas ofertadas por IVAMI  y muestras requeridas).

Cuando la bacteria Clostridium botulinum, productora de la toxina, pueda encontrarse en la muestra se recomienda realizar el cultivo previo, para investigar la toxina después de haber cultivado la muestra. Este es el caso de las heces de un paciente afecto de botulismo infantil o de botulismo intestinal, de los restos de un alimento ingerido en el que hubiese proliferado la bacteria (por ej., una conserva), de un alimento sospechoso que pudiese contener la bacteria proliferando (por ej., una conserva abombada), un alimento sometido a control en el se desee excluir la presencia de esta bacteria (por ej., embutidos como jamones),  o de otras muestras como los lodos acuáticos o marinos, etc., de zonas donde se haya observado mortalidad de las aves acuáticas.

Durante el cultivo en el laboratorio, en los medios de cultivo adecuados, se produce la toxina en caso de que exista la bacteria y al preparar un filtrado del cultivo se puede investigar su presencia, inoculando con el filtrado a ratones, que en caso de afectarse indicará la presencia probable de Clostridium botulinum en la muestra/producto cultivado. No obstante, los ratones pueden haber fallecido por otra causa, por lo que es necesario, antes de emitir el informe, comprobar que realmente han fallecido por haberles inoculado toxina botulínica.

Para confirmar la presencia de toxina botulínica en el cultivo se puede realizar la prueba de neutralización utilizando antisueros específicos de cada tipo de toxina botulínica (prueba de neutralización), o bien detectar la presencia de Clostridium botulínum y su tipo en el medio de cultivo (detección molecular por PCR).

La prueba de neutralización se realiza enfrentando el producto inoculado (filtrado de cultivo) a antisueros específicos de cada tipo de toxina.

Como paso previo a la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis mínima mortal (d.m.m.). De esta forma se calcula la dilución máxima (la más elevada) que provoca la muerte de los animales inoculados, y el volumen inoculado que ha provocado la muerte de los animales contendrá una dosis mínima mortal.

Para identificar el tipo de toxina, una vez titulada y conocida la “dosis mínima mortal”, se realizará el enfrentamiento de una dosis mínima mortal con los distintos tipos de sueros anti-botulínicos. Estas mezclas serán inoculadas en igual volumen a los animales de experimentación y aquellos que sobrevivan, habrán sido inoculados con la mezcla de “dosis mínima mortal” más un antisuero frente a un tipo que ha sido capaz de neutralizarlo.

La detección molecular por PCR evita el tiempo requerido para calcular la dosis mínima  mortal (d.m.m.) y la prueba de neutralización.

Detección de anticuerpos anti-toxina botulínica (para muestras recomendadas ver después en el apartado de pruebas ofertadas por IVAMI  y muestras requeridas)

La detección de anticuerpos anti-toxina botulínica tiene interés en los siguientes casos:

• Pacientes en tratamiento con toxina botulínica diluida, como los que reciben bótox para tratamientos estéticos o médicos (ej. dolor facial por neuralgia del trigémino), para detectar la presencia de anticuerpos que puedan impedir su acción.

• Pacientes con sospecha de botulismo infantil o botulismo del adulto en los que no se haya podido encontrar la bacteria Clostridium botulinum o su toxina en heces, ni la toxina en suero.

• Individuos vacunados en los que interese comprobar el estado de protección.

La toxina de Clostridium botulinum, a diluciones muy elevadas, se ha usado mediante administración local para tratar procesos espásticos. En estos procesos se ha demostrado que puede ser un remedio útil. Estos procesos espásticos suelen ser crónicos por lo que requieren que se administre la toxina de forma duradera. Por ello, pueden surgir  resistencias durante el tratamiento debido a la inmunización progresiva del paciente a lo largo del tratamiento, en cuyo caso el remedio sería limitado. Para detectar esta inmunización se requiere medir de forma precisa y sensible la existencia de anticuerpos frente a la toxina botulínica A y/o B.

El método de referencia aceptado para detectar y cuantificar los anticuerpos frente a la toxina botulínica es la prueba de neutralización en ratón (Mouse Neutralization Assay), en el que una solución de la toxina botulínica, cuantificada en Dosis Letal 50% para el ratón (DL₅₀), se mezcla con varias diluciones en base 2 ó en base 4 del suero/plasma problema, y tras una incubación se inocula por vía intraperitoneal a unos lotes de ratones. La dilución más elevada del suero problema que reduzca la toxicidad es el título de anticuerpos frente a la correspondiente toxina botulínica del suero. Esta dilución, comparada con un standard internacional permite obtener los resultados en unidades internaciones (UI/mL) (1 U.I. se define como la cantidad de anticuerpos que neutraliza 10.000 DL₅₀ de toxinas A o B, o 1.000 DL₅₀ del tipo E). La cantidad de toxina utilizada en las pruebas es aquella que es neutralizada por 0,02; 0,005 y 0,0125 UI/mL de antitoxina para los tipos A, B y E, respectivamente (Hatheway et al. 1984). Los sueros que no protegen al ratón al título de 1:4 se informan como <0,08 UI/mL para el tipo A, o <0,02 UI/mL para el tipo B. Esta prueba es laboriosa, costosa y de larga duración de realización, por lo que se han buscado alternativas basadas en métodos de enmzimoinmunoanálisis (ELISA) utilizando microplacas recubiertas de toxina botulínica. Sin embargo, los valores obtenidos por ELISA, a veces, no se correlacionan completamente con la prueba de neutralización en ratón.

Como paso previo a la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis mínima mortal (d.m.m.) de toxina. El cálculo de la dosis mínima mortal se realiza diluyendo en base 10 el filtrado de un cultivo, diluyendo a la mitad con solución salina fisiológica para obtener la misma dilución que la toxina mezclada con suero o plasma de paciente, e inoculando con cada mezcla de dilución unos animales de laboratorio. De esta forma se calcula la dilución máxima (la más elevada) que provoca la muerte de los animales inoculados. El volumen inoculado que ha provocado la muerte de los animales contendrá una dosis mínima mortal.

Una vez conocida la dosis mínima mortal, hay que calcular la dosis mínima no mortal (d.m.n.m.) que corresponde a la cantidad mínima de toxina que en presencia de una cantidad constante de antitoxina, no provoca la muerte de los ratones inoculados. Esta cantidad de toxina es la que es neutralizada por las unidades correspondientes de antiotoxina anti-A, o de antitoxina anti B. Se llama dosis mínima no mortal porque es la mínima cantidad de toxina  que no provoca la muerte de los ratones en presencia de antitoxina.

Pruebas ofertadas por IVAMI y muestras requeridas:

• Detección de toxinas en casos/brotes humanos de botulismo alimentario:

• • Suero del paciente, como mínimo 5 mL obtenidos lo más recientemente posible, para inoculación en ratones y para tipado de toxina, en caso de que se afectasen  los ratones.

• • En los casos de botulismo infantil o de botulismo intestinal puede detectarse la presencia de toxina botulínica en las heces de los niños/pacientes, pero consideramos más recomendable realizar un cultivo previo de las heces (ver después). 

• Detección de toxina y/o de Clostridium botulinum en alimentos ingeridos, sospechosos de causar botulismo, o en alimentos sometidos a control

• • Muestra del alimento sospechoso o sometido a control (se recomiendan un mínimo de unos 100 gramos) para preparar un extracto destinado a la inoculación de animales y con ello detectar la presencia de la toxina preformada en el alimento, y al mismo tiempo para preparar un cultivo del que obtener el filtrado para inocular animales y conocer si en la muestra existía la bacteria productora de toxina; si sólo se dispone de restos del alimento, se recomienda enviar toda la cantidad disponible.

• Detección de Clostridium botulinum en casos de botulismo infantil o de botulismo intestinal

• • Heces en casos de botulismo infantil o de botulismo intestinal (10 g), producidos por la colonización intestinal, para realizar el cultivo y detección de la toxina en el filtrado de los cultivos mediante inoculación a ratones.

• Detección de Clostridium botulinum en casos de botulismo de heridas

• • Exudado de heridas en los casos de sospecha de “botulismo de heridas”, para realizar el cultivo y detección de la toxina en el filtrado de los cultivos mediante inoculación a ratones. Si por las circunstancias del transporte de la muestra en aerobiosis pudiera haberse inactivado Clostridium botulinum, se podría proceder a realizar una prueba molecular para detectar la presencia de genes de Clostridium botulinum, y en caso de ser positiva, identificar el tipo mediante detección de los genes correspondientes de cada tipo de toxina.

• Detección de Clostridium botulinum en muestras de lodos/sedimentos acuáticos o marinos, y otros productos no incluidos en los apartados anteriores

• • Muestras de unos 100 g, aproximadamente, para preparar un cultivo de Clostridium botulinum y a partir del cultivo preparar un filtrado para inocular animales. 

• Detección de anticuerpos anti-toxina botulínica en suero o plasma

• • Muestras de suero o plasma (unos 10 mL), para realizar pruebas de neutralización enfrentando diluciones del suero/plasma a las diferentes toxinas disponibles en el laboratorio. Esta prueba tiene interés para determinar la presencia de anticuerpos específicos en personas tratadas con toxina botulínica, en pacientes con sospecha de botulismo infantil o del adulto en los que no se haya podido encontrar la bacteria en heces, o en individuos vacunados para comprobar el estado de protección. Debe indicarse el tipo de toxina administrado al paciente).

Tiempos de realización:

• No podemos dar tiempos exactos. En caso de realizarse únicamente la detección de la  toxina en los ratones y ser negativa, el informe estaría en un máximo de una semana. En caso de realizarse cultivo de la muestra, y posteriormente la detección de la toxina inoculando filtrados de cultivo a lotes de ratones, el tiempo sería de dos semanas. Si alguna de estas pruebas de inoculación a ratones, con extracto de una muestra o con el filtrado de cultivo de enriquecimiento, fuese positiva debe realizarse la prueba de neutralización en ratones para corroborar que se trata de la toxina botulínica e identificar su tipo por pruebas de neutralización, cuyo tiempo de realización es de 15 días.

• Las pruebas de PCR en tiempo real tienen un tiempo de realización de 3 ó 4 días laborables.

Formulario con características del producto y prueba/s elegidas

• En caso de solicitar la realización de las pruebas debe remitirnos con el producto un escrito en el que se indicarán las características del producto y las pruebas elegidas que deseen que se realicen con la muestra remitida. 

Volumen de muestra

• Ver en cada caso previamente, según el tipo de pruebas ofertadas por IVAMI.

Condiciones de conservación y envío de las muestras

• Deben conservarse y enviarse en las condiciones en las que se encuentre habitualmente la muestra, protegida para el transporte. En el caso de muestras que puedan descomponerse por estar contaminadas con bacterias, o por su propia naturaleza orgánica  (alimentos perecederos, sueros de animales o de personas, heces, lodos, …..), las muestras deben conservarse y enviarse congeladas, o al menos en las condiciones que garanticen la refrigeración durante el transporte (envase con la muestra en el interior de una caja de poliestireno expandido –corcho blanco- con acumuladores de frío congelados –packs congelados-). Nota: este microorganismo no supone un riesgo biológico de contaminación por exposición .

Coste de las pruebas

• Detección de toxinas en casos/brotes humanos de botulismo alimentario

• • Prueba de inoculación a ratones con suero o con extracto del alimento ingerido…………………………………...…...............……….. Consultar a ivami@ivami.com.

• • En caso de ser positiva, prueba de confirmación por neutralización e identificación del tipo de toxina …………….......................……………………...…… Consultar a ivami@ivami.com.

• Detección de toxina y/o de Clostridium botulinum en alimentos ingeridos, sospechosos de causar botulismo, o en alimentos sometidos a control

• • Prueba de cultivo, seguido de inoculación a ratones con filtrado de los cultivos ………………………………………................…….…………... Consultar a ivami@ivami.com.
  • En caso de ser positiva, prueba de confirmación por neutralización e identificación del tipo de toxina …..………………………........................………….… Consultar a ivami@ivami.com.
  • Alternativa: Prueba de cultivo, seguido de detección molecular por PCR de la presencia de Clostridium botulinum  …………….....................................….. Consultar a ivami@ivami.com.
  • Alternativa: Identificación del tipo de toxina mediante PCR en tiempo real para cada uno de los genes productores de toxina botulínica .........................…. Consultar a ivami@ivami.com. 

• Detección de Clostridium botulinum en casos de botulismo infantil o de botulismo intestinal 

• • Opcional: Prueba de inoculación a ratones con suero o con extracto del alimento ingerido…………..…………………..............…………...…….. Consultar a ivami@ivami.com.
  • Recomendada: Prueba de cultivo, seguido de inoculación a ratones con filtrado de los cultivos …..……..…….………………………..................…….. Consultar a ivami@ivami.com.
  • En caso de ser positiva, prueba de confirmación por neutralización e identificación del tipo de toxina ..………………………......................…………….…. Consultar a ivami@ivami.com. 

• Detección de Clostridium botulinum en casos de botulismo de heridas 

• • Prueba de cultivo, seguido de inoculación a ratones con filtrado de los cultivos …..…………….…..…………….………….....................………….. Consultar a ivami@ivami.com.
  • En caso de ser positiva, prueba de confirmación por neutralización e identificación del tipo de toxina …..……………….…………….......................………. Consultar a ivami@ivami.com.

• Detección de Clostridium botulinum en muestras de lodos/sedimentos acuáticos o marinos, y otros productos no incluidos en los apartados anteriores

• • Prueba de cultivo, seguido de inoculación a ratones con filtrado de los cultivos …..…………….…..…………………….......................…………….. Consultar a ivami@ivami.com.
  • En caso de ser positiva, prueba de confirmación por neutralización e identificación del tipo de toxina ….………………….........................…………………. Consultar a ivami@ivami.com.

• Detección de anticuerpos anti-toxina botulínica en suero o plasma (un tipo de anticuerpos, por lo que debe indicarse el tipo de toxina administrada al paciente)………….......

…………………….…………………....................………………….  Consultar a ivami@ivami.com.