VIH-1. Tropismo viral para receptores CCR5 y CXCR4. Secuenciación del gen de V3 para quasispecies con tropismo CCR5 y CXCR4.
VIH-1 infecta las células por su tropismo por el receptor CD4 y por la unión a uno de los receptores de quimioquinas CCR5 ó CXCR4. Existen quasispecies del virus con afinidad por uno de los dos receptores -monotrópicas-, bien por el correceptor CCR5 (virus R5) o por el correceptor CXCR4 (virus X4), y quasispecies con doble tropismo -dualtrópicas- con tropismo por ambos receptores (virus X4R5). Estas quasispecies, además de tener el tropismo indicado también se han relacionado con los estadios de la infección, con la evolución de la infección y con la tendencia a la progresión de la enfermedad.
Los fármacos antagonistas de CCR5, de los que ya está en uso el "Maraviroc y Vicriviroc", tratan de bloquear la infección celular por las quasispecies de VIH-1 que utilizan al correceptor CCR5. Por este motivo, interesa conocer si un paciente tiene una u otra de las variantes, R5 ó X4, ya que si posee la variante X4 no es candidato para ser tratado con los fármacos antagonistas de CCR5.
El procedimiento utilizado de referencia para conocer el tipo de tropismo de la quasispecie mayoritaria que infecta a un paciente, ha sido una prueba de tropismo mediante ensayos fenotípicos para determinar el uso del correceptor (prueba Trofile HIV Co-receptor Tropism assay, PhenoSense HIV-Entry Assay, Monogram Bioscience, o prueba TRT -Tropism Recombinant Test, Eurofins Viralliance Inc.). Estas pruebas se basan en utilizar unas células productoras de seudovirus, como las 293 ó 293T, en el que se han introducido los genes de la glucoproteína de envoltura gp120 obtenidos del paciente, clonados y transfectados a las células, junto con seudovirus clonado de VIH sin los genes de la proteína de envoltura para obtener los seudovirus infectantes. Posteriormente unas células diana con los receptores CD4 y uno de los dos correceptores, CCR5 ó CXCR4 (U87-CD4-CCR5 y U87-CD4-CXCR4 en la prueba Trofile; U373-CD4-CCR5 y U373-CD4-CXCR4 en la prueba TRT), son infectadas con el seudovirus recombinante, que serán infectadas en función del correceptor que posea, y así poder determinar la quasispecie R5 ó X4 existentes en el paciente.
Los métodos fenotípicos (Trofile y TRT) no son asequibles a la mayoría de los laboratorios, y por otra parte el tiempo requerido para su realización impide disponer e un resultado inmediato para uso clínico, por lo que se han tratado de buscar métodos genotípicos que pudiesen correlacionarse con los métodos fenotípicos.
La parte de la glucoproteína gp120 de la que depende la interacción con el correceptor sería la correspondiente a las asas V1-V2 y V3, preferentemente V3. Por esta razón, se ha buscado un método genotípico que pudiese ser utilizado para predecir el tropismo de los virus existentes en el paciente. El principal problema ha sido correlacionar la secuencia de aminoácidos obtenida de la región V3 de la glucoproteína gp120, con el tropismo del virus, debido a que en el tropismo no sólo influye la secuencia de los aminoácidos existente en los epítopos de interacción del virus con el receptor celular CCR5 ó CXCR4, sino también la disposición conformacional de esa secuencia de aminoácidos. Actualmente se admite que cambios mínimos en la secuencia de aminoácidos del asa V3 de la glucoproteína de envoltura gp120 son suficientes para cambiar el uso del correceptor CCR5 por el CXCR4. Al mismo tiempo, algunos cambios en la secuencia V1-V2 podrían influir en el uso de uno u otro de los correceptores.
Hoy se conoce que la secuencia del asa V3 de la glucoproteína de envoltura gp120 es muy polimorfa, y que incluso un 7,3% de los pacientes que no han recibido tratamiento con antagonistas de CCR5 (Maraviroc) poseen mutaciones en V3 que confieren resistencia a los antagonistas de CCR5.
Con los conocimientos disponibles, y los estudios que han investigado la correlación entre los resultados de pruebas genotípicas y fenotípicas se ha llegado a la conclusión de que los cambios genotípicos que determinan la secuencia de aminoácidos, no son suficientes para conseguir una buena sensibilidad y especificidad con los resultados obtenidos, por lo que han establecido unas reglas que permiten con bastante sensibilidad y especificidad poder conocer la variante de virus existente en el paciente.
Actualmente parece que lo más aceptado es seguir la regla 11/25. Esta regla propone que un aminoácido básico (R -arginina- o K -lisina-) en la posición 11 ó 25 de la región V3 se asocia con el tropismo por el correceptor CXCR4, mientras que la presencia de aminoácidos acídicos o neutros en estas posiciones se asocian con el uso del correceptor CCR5. No obstante, únicamente con esta regla no puede determinarse completamente la sensibilidad y especificidad para conferir el tropismo.
La regla de la carga neta propone que una carga neta mayor o igual +5 en el asa V3 (calculada sustrayendo el número de cargas negativas de los aminoácidos "D"-aspartato- y "E" -glutamato- del número de los de cargas positivas (K -lisina- y R -arginina-) se asocia con el uso del correceptor CXCR4, mientras que una carga neta < + 5, se asocia con el correceptor CCR5.
Con la combinación de de la regla 11/25 y la regla de carga neta se mejora la sensibilidad al 93% y la especificidad al 100%, con un valor predictivo positivo del 100%, y un valor predictivo negativo del 96,7 para el uso del correceptor CXCR4. Para otros autores la sensibilidad sería 88% y la especificidad 96%.
Existen varias herramientas informáticas que pueden ayudar a conocer con bastante precisión el fenotipo de virus predominante en un paciente (R5 ó X4) a partir del genotipo obtenido. En nuestro laboratorio utilizamos los algoritmos PSSM (Position-specificc scoring matrices) y Geno2-pheno.
A partir de la secuencia de V3 obtenida, con el uso de tales herramientas bioinformáticas se determina con bastante sensibilidad y especificidad el tropismo de la quasispecie mayoritaria y si el paciente posee la quasispecie R5 (tropismo CCR5) o la X4 (tropismo CXCR4).
Pruebas realizadas en IVAMI:
- Amplificación y secuenciación de la región genómica que codifica la región V3 de la glucoproteína gp120 de envoltura.
- Sangre no coagulada extraída con EDTA (5 ml), o plasma separado de sangre no coagulada extraída con EDTA.
Refrigerada durante menos de 2 días (sangre no coagulada o plasma).
Congelada (plasma separado de sangre completa).
Coste de la prueba:
Consultar a ivami@ivami.com