Virus Herpes simple (Herpes simplex). Resistencias a aciclovir, penciclovir,  foscarnet, cidofovir y adefovir- (genes UL23-timidinaquinasa-  y UL30 -ADN-polimerasa-): Pruebas genotípicas (PCR y secuenciación) y pruebas fenotípicas (cultivo y determinación de IC50) 

 

Información 10-02-11.

 

Virus Herpes simple (Herpes simplex virus), tipos 1 y 2 (VHS-1 y VHS-2) causa habitualmente infecciones orolabiales y genitales, pero puede causar infecciones oculares (queratitis herpética), meningoencefalitis, e infecciones mucocutáneas agudas y de otras localizaciones en pacientes inmunocomprometidos en los que habitualmente las afecciones son autolimitadas. Sin embargo, las infecciones pueden diseminarse y prolongarse en pacientes inmunocomprometidos, como los infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), los receptores de trasplantes de órganos sólidos o los receptores de trasplantes de médula ósea. 

La transmisión ocurre por contacto con secreciones de una persona infectada, tanto con infecciones clínicas o asintomáticas, que eliminan el virus. Después de la infección primaria, virus Herpes simple establece una latencia prolongada en los ganglios nerviosos sensitivos y puede reactivarse periódicamente. Las reactivaciones pueden manifestarse clínicamente o pueden ser silentes y asintomáticas. Las manifestaciones clínicas más frecuentes son lesiones vesiculares que afectan las membranas mucosas, principalmente de la boca, nariz u ojos para VHS-1 y la región anogenital para VHS-2, aunque cada vez se encuentran más infecciones genitales por VHS-1. Al ser la sintomatología causada por ambos, en general, autolimitada,  el tratamiento persigue acelerar la curación de las lesiones y prevenir la transmisión en los individuos inmunocompetentes. Tanto VHS-1, como VHS-2 pueden provocar ocasionalmente infecciones graves como encefalitis e infecciones diseminadas neonatales. Las infecciones por VHS pueden ser graves en pacientes inmunocomprometidos, principalmente aquellos con alteración de la inmunidad celular. En los infectados por VIH y en receptores de trasplantes de órganos sólidos o de médula ósea, puede provocar infecciones extensas, que tienden a ser prolongadas y a diseminarse. En los pacientes inmunocomprometidos, además de las lesiones mucocutáneas persistentes, puede provocar infecciones viscerales de otra localización como esofagitis, hepatitis o neumonía.

Actualmente se dispone de varios fármacos antivirales para las infecciones por virus Herpes simple como son: aciclovir (con su profármaco valaciclovir), penciclovir (con su profármaco famciclovir), foscarnet, cidofovir y adefovir. Aciclovir es el fármaco antiviral más utilizado, ya que además del tratamiento de las infecciones por virus Herpes simple, se utiliza para el tratamiento de las infecciones por virus Varicella-Zoster (VZV): Varicella y Herpes zoster.

Aciclovir (ACV) es un análogo del nucleósido de guanina, que requiere ser fosforilado tres veces para poder ser incorporado a la síntesis de ADN viral durante la replicación del virus. En la primera fosforilación participa una encima de origen vitral (timidinaquinasa –TK-), mientras que en la segunda y tercera fosforilación participan dos quinasas celulares. Una vez se ha fosforilado completamente, el aciclovir-trifosfato (ACV-TP) actúa competitivamente con la ADN-polimerasa viral y es incorporado en la síntesis de ADN viral. Al incorporarse el análogo fosforilado, que carece del grupo hidroxilo en posición 3´, no puede continuarse la síntesis por lo que actúa como un terminador de cadena y se detiene la replicación del ADN viral. Aciclovir es muy activo frente a VHS-1, posee la mitad de actividad frente a VHS-2, una décima parte de actividad frente a virus Varicella-zoster y virus de Epstein-Barr, y menos actividad frente a Citomegalovirus. La mayor limitación de aciclovir es su limitada biodisponibilidad oral, por lo que se desarrolló un derivado, el profármaco l-valyl-ester (valaciclovir), que proporciona un 56% de aciclovir tras su absorción. Valaciclovir (VACV), un profármaco que se convierte in vivo en aciclovir después de la administración oral, y es absorbido por un péptido transportador intestinal humano tras la hidrólisis del derivado ester en el intestino delgado. Los comentarios expuestos para aciclovir son aplicables a valaciclovir.

Penciclovir (PCV) es un derivado de guanina acíclico con un espectro de actividad similar a aciclovir. Posee un grupo hidroxilo 3´en su cadena lateral acíclica cuyo derivado trifosfato (PCV-trifosfato) permite una elongación limitada (terminador de cadena corta). Su actividad es dos veces inferior a la de ACV. Debido a su limitada absorción, se desarrolló su profármaco famciclovir (FCV) que es un diacetilester del 6-deoxipenciclovir. El primer grupo acetil se elimina por las esterasas de la mucosa intestinal al absorberse, y el segundo grupo acetil se elimina en el hígado. La conversión de 6-deoxipenciclovir a PCV se realiza por la aldehido-oxidasa hepática.

Foscarnet es un análogo del anión pirofosfato (phosphonoformic acid) que inhibe la replicación del ADN viral uniéndose al lugar de unión a pirofosfato de la ADN-polimerasa viral. Así se bloquea la liberación de pirofosfato del nucleótido trifosfato terminal añadido en la cadena de crecimiento del ADN, y actúa como un inhibidor no-competitivo de la actividad de la ADN-polimerasa. Su acción la ejerce a concentraciones que no inhiben a las ADN-polimerasas humanas. A diferencia de lo que ocurre con aciclovir, foscarnet no necesita ser activado por quinasas virales, ni celulares, por lo que puede utilizarse para tratar infecciones por virus Herpes simple resistentes a los análogos de nucleósidos. Foscarnet es activo frente a todos los herpesvirus, aunque su principal indicación son las infecciones por Citomegalovirus resistentes a ganciclovir, y se considera un fármaco de segunda línea para la terapéutica de las infecciones por virus Herpes simple. Sin embargo, las cepas de virus resistentes a aciclovir por mutaciones de la ADN-polimerasa pueden ser resistentes a foscarnet.

Cidofovir es un análogo acíclico del nucleótido citidina [(S)-1-(3-hidroxi-2-fosfonil-metoxi-propil)-citosina], que no requiere la fosforilación por quinasas virales, y se transforma en deoxicitidina-trifosfato por las quinasas celulares actuando como un terminador de cadena al ser incorporado por la ADN-polimerasa viral en la replicación del ADN viral. Este fármaco se introdujo para el tratamiento de la retinitis por Citomegalovirus, pero se ha demostrado activo frente a las cepas de virus Herpes simple resistentes a aciclovir y/o foscarnet, causantes de infecciones mucocutáneas progresivas por VHS en pacientes inmunocomprometidos, aunque no fue aprobado para esta indicación. Es activo in vitro frente a otros virus ADN: Adenovirus, poliomavirus –virus BK-, Papillomavirus y Poxvirus.

Adefovir es un análogo de la adenina [(S)-1-(3-hidroxi-2-fosfonil-metoxi-propil)-adenina] que tampoco requiere la fosforilación por quinasas virales y es activo frente a virus de hepatitis B y también frente a virus del grupo Herpes. Cidofovir y adefovir, al no requerir la activación por la timidinaquinasa (TK), son activos frente a los aislados de Herpes simple TK-negativa o TK-alterada. Sus formas activas, son inhibidores competitivos de la ADN-polimerasa y actúan como terminadores de cadena.

Mutaciones de resistencia a aciclovir

Los cambios de la timidinaquinasa (TK), responsables de resistencia a aciclovir, con resistencia cruzada con penciclovir, son los más frecuentes y aparecen en el 95% de los aislados resistentes. Se han descrito tres tipos de resistencias frente al aciclovir debidas a alteraciones de la timidinaquinasa (TK):

    • Mutantes TK-negativas, que no tienen proteína funcional para realizar la fosforilación del análogo del  aciclovir.
    • Mutantes TK-parciales, que tienen una concentración de TK demasiado bajas para poder realizar una fosforilación eficiente del aciclovir.
    • Mutantes TK-alteradas, que producen una enzima que fosforila el aciclovir de forma menos eficiente.

Desde la introducción de aciclovir en la década de los 80 (1980s), ha sido el fármaco de elección para la profilaxis y tratamiento de las infecciones por virus Herpes simple. A pesar del amplio uso de aciclovir, la prevalencia de aislados resistentes se considera baja. En los pacientes inmunocompetentes se calcula que es del 0,5%. Las infecciones por VHS resistentes a aciclovir son un problema clínico importante en los inmunocomprometidos. En estos pacientes la prevalencia de resistencia es de alrededor del 5%, pero puede llegar al 14-30% en los trasplantados de médula ósea alogénica. Las lesiones pueden hacerse crónicas y extensas con riesgo de diseminación. El cambio a una terapéutica con los otros fármacos que no requieren la acción de la timidinaquinasa, como son foscarnet, cidofovir o adefovir, debe realizarse lo antes posible para que sea efectivo.

La timidinaquinasa es una proteína de 376 aminoácidos codificada por el gen UL23 de 1.128 pb con seis regiones conservadas incluyendo un lugar de fijación de ATP (aa 51 a 63), un lugar de fijación a nucleósidos (aa 168 a 176), y una cisteína en el codón 336, importante para la conformación tridimensional funcional del lugar activo de la enzima. Existen seis regiones altamente conservadas en la enzima TK localizadas en los aminoácidos 56 a 62 (lugar 1), 83 a 88 (lugar 2), 162 a 164 (lugar 3), 171 a 173 (lugar 4), 216 a 222 (lugar 5), y 284 a 289 (lugar 6). La TK de VHS-2 posee 375 aminoácidos con los seis dominios  conservados en los aminoácidos 56 a 62, 83 a 88, 163 a 165, 172 a 1q74, 217 a 223 y 285 a 290.  

La caracterización de los aislados sensibles a aciclovir ha demostrado que existe un elevado polimorfismo en la secuencia del gen UL23 de la timidinaquinasa (TK). Estas mutaciones no están asociadas con resistencia y están localizadas fuera del lugar activo de la enzima. Este hecho es importante, ya que cuando se realiza la determinación de las resistencias por pruebas genotípicas, el hallazgo de variaciones (mutaciones) en la secuencia genómica del gen URL23, no implica siempre la existencia de una resistencia al fármaco.

La mitad de los casos de resistencia a aciclovir se deben a inserciones (adiciones) o deleciones de nucleótidos, que ocurren habitualmente en las regiones homopolíméricas repetidas de nucleótidos de guanina (Gs) o de nucleótidos de citosina (Cs) en el gen UL23, donde inserciones (adiciones) o deleciones dan lugar a un desplazamiento de lectura que genera una enzima truncada no funcional. Los dos homopolímeros más largos, uno de 7 Gs y uno de 6 Cs, son los lugares donde con más frecuencia se encuentran mutaciones en los aislados clínicos resistentes a ACV. Otras secuencias mutadas de UL23 poseen una deleción en la cadena de 3 Cs o una deleción de G de una secuencia de 3 Gs. La mitad de los demás casos se deben a la sustitución de nucleótidos, la mayoría de ellos en los lugares activos o conservados del enzima.

Las principales mutaciones descritas en el gen UL23 (TK) son las siguientes:   

Inserciones y/o deleciones de Gs, Cs, As o Is, en regiones homopoliméricas (d: deleción; i: inserción; d/i: ambas) (subrayado en VHS-2):

180-183 (d) 4Gs; 184-187 (d) 4As; 215-217 (d) 3Cs; 219-222(d) 4Gs; 430-436 (i/d) 7Gs; 433-439 (i/d) 7Gs; 455-458 (d) 4Cs; 460-464 (d) 5Cs; 519-521 (d) 3Cs; 548-553 (i/d) 6Cs; 551-556 (i/d) 6Cs; 586-590 (i) 5Cs; 626-627 (i) 2Is; 668-669 (d) 4Cs; 808-811 (d) 4Cs; 878-880 (d) 3Gs; 896-900 (d) 5Cs; 1061-1064 (d) 4Cs.  

               Mutaciones en lugares conservados (subrayado en VHS-2):

      • Lugar 1 (aminoácidos 56 a 62): R51W, Y53stop, D55N, G56S/V, P57H, H58R/L, G59R/V, G59P, G61V, K62N, T63A/I/S.
      • Lugar 2 (aminoácidos 83 a 88): E83K, P84S,
      • Lugar 3 (aminoácidos 162 a 164): D162A, R163H.
      • Lugar 4 (aminoácidos 171 a 173): A68T, P173L/R, A175V, R176Q, R177W.
      • Lugar 5 (aminoácidos 216 a 222): R216H/C/S, R217H, R220C/H, R222C, R223H.
      • Lugar 6 (aminoácidos 284 a 289): T287M, L297S.
      • Cisteína 336 o 337: C336Y, C337Y.

Mutaciones en lugares no conservados (subrayado en VHS-2): T65N, Q104H/stop; Q105P, H105P, Q125E/L, P131S, T131P, Q144N, L158P, A167V, T245M, S182N, Q185R, V187M, A189V, G200C, T201P, E201D, R271V, P272S, D273R, R281stop, L364P.

Mutaciones de resistencia de la ADN-polimerasa

Las mutaciones de la ADN-polimerasa son menos frecuentes y se admite que sólo ocurren en el 5% de los aislados de virus Herpes simple resistentes a aciclovir.

 

La ADN-polimerasa viral es un heterodímero codificado por los genes UL30 y UL42, con 1.235 y 1.240 aminoácidos, en VHS-1 y VHS-2, respectivamente. El gen UL30 codifica la subunidad catalítica, mientras que el gen UL42 codifica una fosfoproteína con actividad para fijarse a la doble cadena de ADN. La ADN-polimerasa de virus Herpes simple es una enzima multifuncional con actividad polimerasa para extender la cadena de ADN, una actividad intrínseca 3´à 5´ exonucleasa correctora de errores y una actividad ARNasa H (RNAse H) que eliminaría los cebadores que iniciarían la síntesis de los fragmentos de Okazaki en la horquilla de replicación. Además, la subunidad catalítica UL30 interaccionaría con la subunidad accesoria UL42 que actúa como un factor de procesamiento. La ADN-polimerasa de Herpes pertenece a la familia de ADN-polimerasas α-like, muy relacionadas con las ADN-polimerasas δ. En la mitad de la porción carboxiterminal de la subunidad catalítica existen regiones conservadas numeradas I a VII según su grado de conservación, siendo la región I la más conservada. Además, contiene una región C-δ, similar a las polimerasas δ celulares. El orden de estas regiones a nivel genómico es: IV, región δ, II, VI, III, I, VII y V.

Las mutaciones de la ADN-polimerasa encontradas en aislados clínicos son sustituciones de aminoácidos localizados en la región II, III, VI y VII, que participan  directa o indirectamente en el reconocimiento, fijación de nucleótidos o pirofosfato, así como en la catálisis. El mayor número de mutaciones se agrupa en las regiones II y III. Las mutaciones en las regiones conservadas II y VII suelen asociarse con resistencia a aciclovir y foscarnet. Se han descrito algunas mutaciones en las otras regiones conservadas o fuera de estas regiones.

            Mutaciones en el gen UL30 (ADN-polimerasa) (subrayadas las de VHS-2)

      • Región IV (aminoácidos 437 a 479; 438-480): --
      • Región δ C (aminoácidos 577-637; 578-638): Y577H; D581A; E597K/D; A605V;
      • Región II (aminoácidos 694-736; 699-741): R700G; V715G/M; A719T/V; A724T; S724N; S729N.
      • Región VI (aminoácidos 772-791; 777-796): L774F; L778M; D780N; D785N, L782I.
      • Región III (aminoácidos 805-845; 810-850): V813M; N815S; T821M; G841S; R842S.
      • Región I (aminoácidos 881-896; 886-901): G885A/R; D886N; T887K; D888A; S889A; F891C/Y; V892M;
      • Región VII (aminoácidos 938-946; 943-951): Y941H.
      • Región V (aminoácidos 953-963; 954-968): N961K.
      • En otras zonas: D368A; E370A; E460D; V462A; G464V; K522E; P561S; V573M; P797T; D907V; D912V/A.

Mutaciones de resistencia de foscarnet     

La mayoría de las mutaciones de resistencia a foscarnet poseen sustituciones de nucleótidos en las regiones conservadas II, III, VI o VII y en una región no conservada entre las regiones I y VII del gen UL30

Algunos aislados conservan su sensibilidad a aciclovir y cidofovir. Sin embargo, las mutaciones en las regiones II y VII pueden conferir resistencia a aciclovir y a foscarnet.

      • Región II: V715G; S724N; S729N
      • Región VII: Y941H.

Mutaciones de resistencia de cidofovir

Las mutaciones asociadas con resistencia a cidofovir se han localizado en las siguientes regiones del gen UL30 (ADN-polimerasa):

      • Región II: R700M.
      • Región III: G841C; G850I.
      • Región VI: L773M.
      • Región VII: Y941H
      • Región δ C: V573M.

Mutaciones de resistencia a adefovir

  Aunque adefovir se introdujo para la terapéutica de infecciones crónicas por virus de la hepatitis B, posee actividad frente a virus Herpes simple, incluido los aislados resistentes a aciclovir y foscarnet. Los aislados resistentes a foscarnet, con mutaciones en las regiones II y VI, y entre las regiones I y VII de la ADN-polimerasa, muestran una disminución de sensibilidad a adefovir, lo que sugiere que se podrían seleccionar aislados de virus herpes simple resistentes a adefovir en pacientes tratados con foscarnet. Las mutaciones S724N y L778M, que confieren resistencia cruzada a aciclovir y foscarnet, causan disminución de la sensibilidad tanto a cidofovir como a adefovir. 

Pruebas fenotípicas para IC50

Las pruebas de resistencia fenotípicas, con exposición de cultivos celulares infectados con el virus a distintas concentraciones de los antivirales, son las pruebas de referencia (Gold standard) ya que permiten demostrar la elevación de las concentraciones inhibidoras frente a cada uno de los fármacos. Estas pruebas no están sujetas a la interpretación de los hallazgos de mutaciones genómicas que pueden no implicar resistencia, sino únicamente un polimorfismo del gen de la timidinaquinasa o de la ADN-polimerasa. El problema de estas pruebas es su lentitud y por ello se han ido sustituyendo por las pruebas de resistencia genotípicas que pueden proporcionar los resultados en un periodo de tiempo mucho más corto, y además puede realizarse directamente con las muestras clínicas, sin necesidad de aislar previamente el virus en cultivo celular.

Pruebas realizadas en IVAMI:

 

  • Pruebas de resistencia genotípicas mediante detección molecular de las mutaciones de resistencia en el gen UL23 (timidinaquinasa) y en el gen UL30 (ADN polimerasa) (PCR y secuenciación).
  • Pruebas de resistencia fenotípicas mediante aislamiento del virus y determinación de las concentraciones inhibidoras IC50 en cultivos celulares.

Muestra recomendada:

 

  • Muestra de lesión herpética. Esta muestra puede utilizarse para las pruebas de resistencia genotípicas y es imprescindible para poder aislar el virus y realizar las pruebas de resistencias fenotípicas (concentraciones IC50).
  • Cepa (aislamiento) de virus Herpes simple aislada en el laboratorio. Esta cepa puede utilizarse para las pruebas de resistencia genotípicas y para las pruebas de resistencia fenotípica.
  • Extraído de ADN de muestra que haya proporcionado una prueba molecular (PCR) positiva para virus Herpes simple. El extraído de ADN sólo puede utilizarse para las pruebas de resistencia genotípica.

 

Conservación y envío de la muestra:

 

  • Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
  • Congelada durante más de 2 días.

 

Coste de la prueba:  

 

Servicio recogida de muestra (incluido sólo en España Península):

 

Solicitar envío de mensajero al teléfono 96-169 17 02.