Pneumocystis jirovecii (antes Pneumocystis carinii) – Diagnóstico molecular (PCR); Mutaciones resistencia al tratamiento de primera línea (TMP-SMX) (PCR y secuenciación).

Información 26-08-2018.

La neumonía causada por el hongo oportunista no cultivable Pneumocystis jirovecii (PcP, debido a sus siglas en inglés, Pneumocystis pneumonia) es una causa importante de morbilidad y mortalidad entre los pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y otros pacientes inmunosuprimidos. La profilaxis y el tratamiento de esta infección se basa principalmente en el uso de la combinación trimetoprim-sulfametoxazol (TMP-SMX) que inhibe dos enzimas secuenciales responsables de la síntesis de ácido fólico. El tratamiento con TMP-SMX está ampliamente disponible y ha reducido eficazmente la incidencia de la neumonía causada por este hongo. Sin embargo, como consecuencia de su uso, se ha descrito la aparición de cepas con mutaciones en los genes de las dos enzimas diana, vinculadas con un mayor grado de resistencia al tratamiento.

Pneumocystis jirovecii es un hongo ubicuo, unicelular, extracelular, que difícilmente se desarrolla en cultivos celulares y no es cultivable en medios sintéticos. La infección por Pneumocystis jirovecii causa una neumonía grave en individuos inmunocomprometidos, como los pacientes infectados por VIH, los receptores de transplantes de órganos, o los pacientes que reciben quimioterapia o tratamiento a largo plazo con glucocorticoides. Sin embargo, no es infrecuente encontrar a pacientes inmunocompetentes pero con alguna alteración, como la fibrosis quística, colonizados por este microorganismo. Aunque usualmente el hongo se encuentra restringido a los pulmones, se ha demostrado su presencia en órganos como ganglios linfáticos, bazo, hígado, médula ósea y corazón.

Una característica estructural de interés de Pneumocystis jirovecii y que lo diferencia del resto de los hongos, es la presencia de colesterol en la membrana celular. La ausencia de ergosterol explica su resistencia natural a la anfotericina B y a los azólicos. Pneumocystis jirovecii, al igual que otros hongos, no puede adquirir el ácido fólico del hospedador y utiliza las enzimas de la ruta de síntesis de folato para su síntesis. Por ello, la profilaxis y el tratamiento de esta infección se basa principalmente en el uso de la combinación trimetoprim-sulfametoxazol (TMP-SMX) para inhibir la síntesis de folato. Esta combinación inhibe dos enzimas en el metabolismo del folato que actual en dos etapas distintas: dihidropteroato sintasa (DHPS) y dihidrofolato reductasa (DHFR). El componente sulfametoxazol inhibe la actividad de la enzima dihidropteroato sintasa y el componente trimetoprim inhibe selectivamente la actividad de la enzima dihidrofolato reductasa.

El uso de estos fármacos, sulfonamidas y trimetoprim se ha asociado con mutaciones en los genes de las enzimas DHPS y DHFR, y como consecuencia, la resistencia a estos fármacos. La exposición a largo plazo a niveles bajos de TMP-SMX se ha identificado como un factor de riesgo para desarrollar una infección con mutantes de DHPS o para seleccionar mutantes de DHPS, lo que sugiere que la presión de selección del fármaco es el mecanismo por el cual ocurre un aumento de mutantes DHPS en P. jirovecii. Los hospitales o las clínicas ambulatorias son probablemente los entornos más relevantes para la selección de Pneumocystis mutantes ya que los pacientes con terapia crónica con sulfonamidas pueden acumular genotipos mutantes y ser un reservorio para la transmisión de cepas de P. jirovecii resistentes.

Un número creciente de estudios han identificado mutaciones en el gen DHPS, principalmente en los codones 55 y 57. Estas mutaciones consisten en cambios puntuales de nucleótidos, que se traducen en sustituciones de aminoácidos en la enzima: 55 Thr-Ala y 57 Pro-Ser. La presencia de dichas mutaciones se asocia con la disminución de la eficacia de las sulfonamidas in vitro, con el fracaso de la profilaxis anti-Pneumocystis, y con tasas más altas de fracaso del tratamiento en pacientes con PcP tratados con trimetoprim-sulfametoxazol intravenoso. Se ha publicado que existe un riesgo tres veces mayor de muerte por neumonía en pacientes infectados con cepas de P. jirovecii portadoras de mutaciones en el gen DHPS. Además, la presencia de ambas mutaciones en una cepa parece aumentar la resistencia de la misma a los fármacos. Otros estudios, indican que el uso de las altas dosis de TMP-SMX para el tratamiento de la PcP podría ser capaz de superar el grado de resistencia conferido por estas mutaciones; sin embargo, el surgimiento de nuevas mutaciones podría cambiar esta situación. Otras mutaciones puntuales han sido detectadas en los codones 23, 60, 111, 171, y 248. Por lo tanto, la vigilancia del genotipo de DHPS en pacientes con PcP parece estar justificada.

La importancia de las mutaciones en la enzima DHFR, diana del trimetoprim, en P. jirovecii ha sido menos estudiada y por lo tanto está menos clara. Sin embargo, existe una fuerte evidencia de resistencia a trimetoprim debido a mutaciones en el gen DHFR en Plasmodium falciparum y otras bacterias patógenas. Se han descrito numerosas mutaciones en el gen DHFR de P.jirovecci, algunas de las cuales (las localizadas en los codones 26, 36, 37, 65, 144) se predice que estarían localizadas en el sitio activo de la enzima. Dichas mutaciones, están conservadas en diferentes aislados de P.jirovecci, y algunas de ellas, coinciden con las mutaciones encontradas en otros microorganismos, por ello, se cree pueden haber sido seleccionadas por la presión de un inhibidor DHFR y pueden conferir algún nivel de resistencia. También, hay una buena evidencia molecular de que las mutaciones de DHFR, que se encuentran con frecuencia en los aislados clínicos de P. jirovecii, afectan gravemente el efecto inhibidor del trimetoprim sobre la actividad enzimática de DHFR in vitro.

Se ha descrito que hay diferencias geográficas en la prevalencia de estas mutaciones en los genes DHPS y DHFR. Así, por ejemplo, la prevalencia de las mutaciones de los codones 55 o 57 del gen de la DHPS es mucho más alta en los Estados Unidos que en los países europeos, variando del 69% a entre 0-36%, respectivamente, según los estudios disponibles.

El diagnóstico de neumonía por Pneumocystis jirovecii (PcP) se basa en manifestaciones clínicas y radiológicas en combinación con los hallazgos microbiológicos. La complejidad del diagnóstico de PCP se debe a la presencia de signos y síntomas inespecíficos y a las limitaciones de sensibilidad de las técnicas de tinción. Las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han mejorado la precisión del diagnóstico microbiológico y pueden ser especialmente útiles en los casos de exámenes microscópicos falsos negativos. Dado que P. jirovecii no puede cultivarse in vitro, y por tanto no pueden emplearse los métodos convencionales para analizar la resistencia a los fármacos. Al mismo tiempo, que se realiza el diagnóstico molecular, la detección de mutaciones en los genes codificantes de las enzimas DHPS y DHFR parece estar justificada por los datos que indican su asociación con la eficacia del tratamiento de primera línea TMP-SMX.

Pruebas realizadas en IVAMI:

• Diagnóstico molecular de las infecciones por Pneumocystis jirovecii mediante PCR.

• Detección de mutaciones en los genes DHPS y DHFR de Pneumocystis jirovecii mediante PCR y secuenciación.

Muestra recomendada:

• Preferiblemente muestras del tracto respiratorio inferior (aspirado endotraqueal, lavado broncoalveolar o biopsia). Se puede aceptar muestras de esputo pero tienen una baja sensibilidad, por lo que no se recomiendan.

Conservación y envío de la muestra:

• Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.

• Congelada: más de 2 días.

Plazo de entrega:

• Diagnóstico molecular de las infecciones por Pneumocystis jirovecii mediante PCR: 24 a 48 horas.

• Detección de mutaciones en los genes DHPS y DHFR de Pneumocystis jirovecii mediante PCR y secuenciación: 3-5 días.

Coste de la prueba:  

• Diagnóstico molecular (PCR): consultar a ivami@ivami.com.

• Detección de mutaciones en los genes DHPS y DHFR de Pneumocystis jirovecii mediante PCR y secuenciación: consultar a ivami@ivami.com