Resistencia a glucopépticos (vancomicina y teicoplanina) en Enterococcus spp. Fenotipos VanA, VanB, VanD, y otros menos frecuentes (VanC, C2/3, E, F, G, L, M): Diagnóstico molecular por amplificación (PCR) y secuenciación.

Información (28-02-15)

 

La resistencia a glucopéptidos en Enterococcus spp. es un problema importante desde su aparición en 1980s debido a su importancia como patógeno nosocomial importante. Los glucopéptidos, vancomicina y teicoplanina, actúan uniéndose al dímero terminal D-alanil-D-alanina (d-Ala-D-Ala) del precursor final para la formación del peptidoglucano, inhibiendo la formación de enlaces cruzados, al bloquear la transglucosilación y la transpeptidación.

La resistencia en Enterococcus spp. es consecuencia de la síntesis de precursores finales del peptidoglucano con baja afinidad para estos antibióticos, debido a que estas bacterias pueden sintetizar un precursor final en el que se sustituye el dímero natural D-Ala-D-Ala por otros dímeros como D-Ala-D-Lac (D-alanil-D-lactosa) o D-Ala-D-Ser (D-alanil-D-serina).  Esta nueva síntesis está mediada por conjunto (cluster) de genes llamados  van. Se han descrito siete tipos de conjuntos de genes que confieren resistencia a Enterococcus en los que existen genes comunes, pero también genes diferentes e incluso diferente organización dentro del conjunto de genes. Los tipos de los conjuntos de genes (cluster) (operón de resistencia a glucopéptidos) se denominan según el nombre del gen que codifica la ligasa. Existen hasta 8 tipos distintos de ligasa, que aunque difieren en sus secuencias, pueden diferenciarse en las que dan lugar al dímero final del precursor: ligasas D-Ala:D-Lac que generaría el dímero D-Ala-D-Lac (codificadas por genes vanA, vanB y vanD), o ligasas D-Ala:D-Ser, que dan lugar al dímero final del precursor D-Ala-D-Ser (codificadas por genes vanC, vanE, vanG y vanL).

Genes presentes en los distintos tipos “van”

Los conjuntos de genes de los tipos vanA, vanB y vanD, generadores del dímero D-Ala-D-Lac, contienen genes para:

• • Sistema regulador de dos componentes: vanR (regulador de la respuesta) y vanS. (sensor de histidinaquinasa). Estos genes controlan la expresión del operón de resistencia.

• • Genes de resistencia: vanH (codifica una deshidrogenasa que reduce piruvato a lactato; pueden verse denominadas vanH, vanH_B, vanH_D); vanA, vanB o vanD que codifican la ligasa de tipo D-Ala:D-Lac.

• • Genes accesorios: vanX (D,D-dipeptidasa, cuya función es hidrolizar el dímero D-Ala-D-Ala del precursor; pueden verse denominadas vanX, vanX_B, vanX_D); vanY (D,D-carboxipeptidasa, cuya función es escindir el último residuo D-alanina C-terminal del dímero D-Ala-D-Ala; pueden verse denominadas vanY, vanY_B, vanY_D); gen vanZ (presente en conjunto de tipo vanA); gen vanW (presente en conjunto de tipo vanB).

• • Gen de función desconocida: vanW (solo en conjunto de tipo vanB).; vanZ (sólo en el conjunto de tipo VanA).

Los conjuntos de genes de los tipos vanC, vanE, vanG y vanL, generadores del dímero D-Ala-D-Ser,  contienen genes para:

• • Sistema regulador de dos componentes: vanR (regulador de la respuesta; por ejemplo vanR_C-2) y vanS (sensor de histidinaquinasa, por ejemplo vanS_C-2).

• • Genes de resistencia: vanH (codifica una deshidrogenasa); vanC, vanC2/3, vanE, vanG o vanL, que codifican la ligasa de tipo D-Ala:D-Ser. De ellos vanC se ha encontrado sólo en Enterococcus gallinarum, y vanC2/3 en Enterococcus casseliflavus/flavescens, llamado así porque algunos dudan de que sean dos especies, ya que ambos presentan pigmentación amarilla; E. flavescens se diferenciaría de E. casseliflavus por la producción de ácido a partir de ribosa.  vanE y vanG, sólo se han encontrado en un pequeño número de Enterococcus faecalis. vanC2 y vanC3 muy relacionados con loci con muy pocas diferencias por lo que se suelen denominar vanC2/3.

• • Genes accesorios: vanT (gen para serina-racemasa que conviertre L-serina en D-serina; denominado por ejemplo vanT_C-2); Genes accesorios: vanU (gen regulador de transcripción en tipo vanG de algunos E. faecalis); vanX (D,D-dipeptidasa, cuya función es hidrolizar el dímero D-Ala-D-Ala del precursor); vanY (D,D-carboxipeptidasa).

• • Gen de función desconocida: vanW (solo en tipo vanG).

El conjunto de genes tipo vanF, con la ligasa vanF, sólo se ha encontrado en la bacteria Paenibacillus popilliae, utilizada en biopesticidas, pero no se ha encontrado en Enterococcus spp.

Secuencia genotípica de algunos tipos “van”

El orden de los genes del operón de  resistencia a los glucopéptidos de algunos de estos tipos serían:

• • Tipo vanA: vanR-vanS-(-vanH-vanA-vanX-)-vanY-vanZ-

• • Tipo vanB: vanRB-vanSB- vanYB-vanW- (-vanHB-vanB-vanXB-)-

• • Tipo vanD: vanRD-vanSD-vanYD-(-vanHD-vanD-vanXD-)-

• • Tipo vanF: vanR-vanS-vanYF-vanZF-(-vanHF-vanF-vanXF-)-vanY- (sólo encontrado en Paenibacillus popilliae).

• • Tipo vanM: vanR-vanS-vanYM- (-vanHM-vanM-vanXM-)-

Características fenotípicas de sensibilidad de cada conjunto de tipo “van”

El conjunto tipo vanA de resistencia se caracteriza por resistencia de alto nivel a vancomicina (>64 μg/mL) y teicoplanina (>16 μg/mL), y es inducible tanto por vancomicina, como por teicoplanina.

El conjunto tipo vanB de resistencia se caracteriza por resistencia adquirida a varias concentraciones de vancomicina (4 a ≥ 1.024 μg/mL), pero no a teicoplanina, y sólo es inducible por vancomicina.

Estos dos tipos, vanA y vanB, son los dos fenotipos más frecuentes de resistencia a glucopéptidos. Los genes que codifican los fenotipos vanA y vanB se encuentran en un transposón (Tn1546), que pueden estar en un plásmido o en el cromosoma.

Los tipos vanC1 y vanC2/C3, se caracterizan por resistencia intrínseca de bajo nivel a vancomicina (2 a 32 μg/mL), y sensibilidad a teicoplanina. Esta resistencia es inducible, por lo que en ausencia de vancomicina, las cepas vanC sintetizan el dímero D-alanil-D-alanina.

El tipo vanE, encontrado en Enterococcus faecalis se caracteriza por bajo nivel de resistencia a vancomicina (16 μg/mL) y sensibilidad a teicoplanina (0,5 μg/mL).

El tipo vanD se caracteriza por resistencia intermedia a vancomicina (128 μg/mL) y de bajo nivel a teicoplanina y se expresa de forma constitutiva. Los genes vanD, se encuentran en el cromosoma y no son transferibles, por lo que son muy raras las cepas vanD, en contraste con la extensión amplia y elevada prevalencia de las cepas vanA y vanB.

El tipo vanG, encontrado en Enterococcus faecalis posee resistencia moderada a vancomicina (12-16 μg/mL) y sensibililidad a teicoplanina (0,5 μg/mL).

El tipo vanM, se encontró al estudiar cepas que no poseen los genes vanA, vanB, ni vanD. Estas cepas poseen un conjunto de genes denominado vanM. El tipo vanM, posee elevada resistencia a vancomicina y teicoplanina, ésta última con CMIs superiores a teicoplanina, que las que posee el tipo vanA. 

Pruebas realizadas en IVAMI

• Diagnóstico molecular por amplificación (PCR) para los tipos genetipos vanA, vanB o vanD, o los otros menos frecuentes (vanC, vanC2/3, vanE, vanF, vanG, vanL, vanM).

• Diagnóstico molecular por amplificación (PCR) para cualquier tipo, seguido de secuenciación para identificar el tipo.

Muestras

• Cultivo con aislado resistente a glucopéptidos.

Conservación y envío de la muestra:

 

• Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.

• Congelada: más de 2 días. 

Coste de la prueba:  

 

• Consultar a ivami@ivami.com