Clostridium tetani – Detección de toxina (inoculación experimental y prueba de neutralización); Anticuerpos IgG; Diagnóstico molecular (PCR y secuenciación).

Información 15-07-18.

El tétanos es una enfermedad potencialmente mortal del sistema nervioso provocada por la toxina tetánica, producida por Clostridium tetani, una bacteria anaeróbica ubicua que se encuentra en el suelo. Una vez que el sistema nervioso capta esta toxina, se bloquean las sinapsis inhibitorias, lo que provoca una rigidez muscular característica, espasmos e inestabilidad autonómica. Afortunadamente, la inclusión de una vacuna con toxoide tetánico en los programas de vacunación infantil en los países desarrollados la ha convertido en una enfermedad rara. Sin embargo, en los países con bajos recursos continúa siendo una enfermedad importante.

El género Clostridium es heterogéneo y se compone de más de 200 especies de anaerobios saprófitos, gram-positivos y formadores de esporas. Las bacterias del género Clostridium se encuentran principalmente en el suelo, y son frecuentes en la flora intestinal humana o de animales. Alrededor de 20 especies de Clostridium son toxigénicas y se asocian con patología, como C. botulinum, C. perfringens, C. difficile y C. tetani. Estas especies producen una o más exotoxinas características, que causan enfermedad al hospedador y, eventualmente, pueden causar la muerte. Dentro de la especie C. tetani, sólo las cepas productoras de toxinas producen enfermedad en humanos o animales. 

Clostridium tetani es un bacilo grampositivo, delgado, anaeróbico obligado y formador de esporas. La bacteria Clostridium tetani se encuentra en el suelo, el polvo, y el tracto intestinal de humanos y animales. Esta bacteria y sus esporas son ubicuas en el medio ambiente, aunque se encuentran con mayor frecuencia en climas cálidos y húmedos, y en áreas agrícolas, donde el suelo es rico en materia orgánica. Sin embargo, también se han detectado esporas de C. tetani en el polvo callejero, de las alfombras, etc. Cuando se someten a condiciones adversas, C. tetani forma esporas redondeadas terminales con mayor diámetro que el resto del bacilo, le otorgan la apariencia general de palillo de tambor. Aunque el organismo es sensible al calor y al oxígeno, sus esporas son altamente resistentes a la desecación, al calor y a la exposición al oxígeno, por lo que C. tetani puede sobrevivir en ambientes como el suelo durante períodos prolongados. Además, las esporas son capaces de resistir a la ebullición y son muy resistentes a muchos agentes químicos, incluidos los desinfectantes domésticos.

Para la germinación y multiplicación de la bacteria, C. tetani requiere bajas tensiones de oxígeno. En el tejido sano bien oxigenado, si se introducen las esporas, no se produce la germinación y las esporas son eliminadas por los fagocitos. Sin embargo, si las esporas se inoculan en un tejido dañado, junto con adyuvantes como tierra, heces, sustancias químicas u otras bacterias, las tensiones locales de oxígeno disminuyen y se crean condiciones favorables para la germinación y el crecimiento vegetativo. Por lo tanto, cualquier violación en las defensas de la piel por heridas, quemaduras, mordeduras de animales, mordeduras humanas, e incluso picaduras de insectos puede resultar en la inoculación de las esporas. También, se han documentado casos de infección a través de procedimientos quirúrgicos, inyecciones intramusculares, fracturas compuestas, e infecciones dentales. Por lo general, C. tetani ingresa a un organismo a través de una herida abierta, donde se dan las condiciones para su germinación y multiplicación. Durante la fase de crecimiento, C.tetani produce dos toxinas, la tetanospasmina o toxina tetánica, y la tetanolisina. Aunque no se conoce completamente el papel de la tetanolisina, se cree que contribuye al establecimiento de la infección en el sitio de inoculación al causar necrosis en los tejidos, que puede servir para disminuir la oxigenación del tejido y promover el crecimiento de la bacteria. La tetanospasmina es una neurotoxina potente, responsable de las manifestaciones del tétanos. Está codificada en un plásmido de 75 kB, lo que explica la existencia de cepas toxigénicas y no toxigénicas, según la presencia o ausencia de este plásmido. Esta toxina se produce como una cadena única de 150 kDa que se somete a escisión postraduccional para formar una cadena pesada (100 kDa) y una cadena ligera (50 kDa) conectada por un puente disulfuro. Cuando C. tetani sintetiza la tetanospasmina en las heridas, la neurotoxina se libera en los tejidos circundantes. La toxina tetánica puede ingresar al sistema nervioso desde el músculo adyacente, o diseminarse a través de los vasos linfáticos y la sangre. Cuando la neurotoxina penetra en las neuronas motoras, se transporta de forma retrógrada al sistema nervioso central. Una vez allí, entra en las interneuronas inhibidoras y bloquea la liberación de neurotransmisores (glicina y GABA) en las terminaciones presinápticas, tras la escisión proteolítica de la proteína SNARE VAMP2. La reducción de la inhibición da como resultado la desinhibición de la descarga de la neurona motora, lo que da lugar a los síntomas característicos de rigidez muscular y espasmos. Los grupos musculares con las vías neuronales más cortas se afectan primero, por lo tanto, el trismus (la contracción constante e involuntaria de los músculos de la mandíbula) y la disfagia (dificultad para tragar) son síntomas tempranos comunes.

El tétanos es una enfermedad usualmente autolimitada, pero de gran mortalidad, especialmente en las edades extremas de la vida, en neonatos y ancianos. La tasa global de mortalidad por tétanos, ha disminuido considerablemente, debido a las campañas intensivas de vacunación. Sin embargo, a pesar de los programas de inmunización generalizados, se siguen informando de un gran número de casos en los países en desarrollo. En países desarrollados, los casos de tétanos ocurren en personas no vacunadas o en personas mayores que han disminuido su inmunidad a lo largo del tiempo. Los usuarios de drogas intravenosas también constituyen un sector de riesgo, debido al posible uso de agujas o drogas contaminadas. El período de incubación de la enfermedad puede durar de 1 a 60 días, pero es, en promedio, de alrededor de 7 a 10 días. La gravedad de los síntomas depende de la distancia del lugar de la infección al sistema nervioso central, con síntomas más pronunciados asociados con periodos de incubación más cortos. Los síntomas pueden durar de semanas a meses con una tasa de mortalidad del 10% de los infectados, siendo mayor en aquellos sin vacunación previa. Además, se han documentado frecuentes complicaciones a largo plazo, neuropsiquiátricas y motrices en los supervivientes, de los que muchos se recuperan por completo.

Existen cuatro formas de tétanos basadas en los hallazgos clínicos: el tétanos generalizado, el neonatal, el local y el cefálico. El tétanos generalizado es la forma más común, y se presenta en aproximadamente el 80% de los casos. Los pacientes presentan un patrón descendente de espasmos musculares, presentándose primero el trismus o cierre de mandíbula. Simultáneamente aparece disfagia y rigidez muscular que afecta progresivamente a los músculos del cuello, hombros, tórax, espalda, abdomen y músculos proximales de los miembros. Otro signo característico, pero menos frecuente, es una mueca de sonrisa fija o rígida denominada risus sardonicus. Estos espasmos pueden ocurrir hasta durante 4 semanas, llevando meses hasta la recuperación completa. Los casos más graves cursan con inestabilidad autonómica, cuyas manifestaciones son diversas: fiebre, arritmia, presión arterial y frecuencia cardiaca inestable, dificultades respiratorias, e incluso muerte prematura. El segundo tipo, el tétanos neonatal, es una forma generalizada de tétanos en recién nacidos de madres no vacunadas o insuficientemente vacunadas debido a la manipulación poco aséptica del cordón umbilical. Sin tratamiento, presenta una elevada mortalidad. El tétanos local y el tétanos cefálico son las formas más raras de tétanos, y ambas pueden progresar a la forma generalizada. El tétanos local es la contracción persistente de los músculos próximos al lugar de la lesión, que puede persistir durante semanas y que tiene buen pronóstico. El tétanos cefálico está limitado a los músculos y nervios de la cabeza, y se produce después de un traumatismo craneal, laceración de la cabeza, lesión ocular, procedimientos dentales, u otitis media. Presenta rigidez en el cuello, disfagia, trismus, párpados retraídos, mirada desviada y risus sardonicus. Se generaliza rápidamente y su mortalidad es elevada.

El tratamiento del tétanos se basa en la gravedad de la enfermedad. Sin embargo, a todos los pacientes se debe realizar un desbridamiento temprano de la herida, terapia con antibióticos, administración intramuscular o intravenosa temprana de la inmunoglobulina antitetánica humana (HTIG) y bloqueo neuromuscular. La terapia de primera línea incluye HTIG que elimina la toxina tetanospasmina libre, pero sin embargo, no afecta a la toxina que ya está unida al sistema nervioso central. El desbridamiento de la herida controlará la fuente de producción de la toxina. Aunque las toxinas son la causa principal de la enfermedad, se ha demostrado que el metronidazol, un antimicrobiano anaerobicida, ralentiza la progresión de la enfermedad.

Además de los humanos, los animales también pueden padecer tétanos. Todas las especies de ganado son susceptibles a la infección por C. tetani. Esta bacteria, se encuentra a menudo como parte de la microflora intestinal de los animales. Los caballos, son la especie doméstica más susceptible, por lo que se recomienda la vacunación de estos animales. Las ovejas y las cabras son más susceptibles que el ganado vacuno. Se pueden presentar casos individuales o pueden producirse brotes en rebaños después de la castración, el etiquetado de las orejas o el descornado. Además, la enfermedad ocurre también, ocasionalmente en perros, y rara vez en gatos.

El diagnóstico de tétanos es generalmente clínico, sin necesidad de una prueba de laboratorio. El diagnóstico microbiológico se basa en el cultivo de las heridas, aunque el aislamiento del microorganismo por cultivo sólo se obtiene en el 30% de los casos. Además, los estudios bacteriológicos de rutina no indican si una cepa de C. tetani es portadora del plásmido de la toxina. Las técnicas de diagnóstico molecular desarrolladas en los últimos años, permiten detectar la presencia de las cepas de C. tetani toxigénicas, al emplear cebadores (primers) dirigidos al gen productor de la toxina tetánica. Además, mediante la inoculación en ratones del suero o plasma de pacientes, o de un filtrado obtenido del cultivo de la bacteria, se puede detectar la presencia de toxinas en el suero o en el cultivo. Sin embargo, si los ratones se ven afectados y fallecen, para confirmar que han fallecido por la toxina tetánica, se debe realizar la prueba de neutralización utilizando antisuero específico de la toxina tetánica (prueba de neutralización), o bien detectar la presencia los genes productores de la tetanoespasmina de C. tetani en el medio de cultivo (detección molecular por PCR).

Pruebas realizadas en IVAMI:

• Detección por aislamiento en cultivo en medios específicos en anaerobiosis.
• Detección por aislamiento en cultivo en medios específicos en anaerobiosis y confirmación de la identificación mediante PCR.
• Detección de anticuerpos.
• Detección molecular de C. tetani (PCR) mediante cebadores (primers) dirigidos al gen codificante de una proteína asociada a la membrana y de cepas toxigénica de C. tetani mediante cebadores (primers) dirigidos al gen de la toxina tetánica.
• Detección de la toxina tetánica por inoculación en ratones (MIT test).
• Detección de la toxina tetánica por inoculación en ratones y confirmación mediante la prueba de neutralización.

Muestras recomendadas: 

• Cultivo de C. tetani y detección molecular: hisopado, biopsia o aspirado de la herida.
• Detección de toxina libre, en humanos o animales, mediante inoculación a ratones: sangre, plasma o suero.
• Detección del microorganismo o sus esporas en muestras ambientales: tierra, heces de animales, muestras de superficies o ambientes.

NOTA: El transporte y el mantenimiento anaeróbico estándar son importantes para el aislamiento en cultivo de la bacteria, aunque no es necesaria para la detección de esporas.

Conservación y envío de la muestra:

• Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
• Congelada: más de 2 días.

Plazo de entrega: 

• Aislamiento en cultivo en anaerobiosis: 3 días
• Cultivo y confirmación de la identificación de las colonias aisladas por PCR: 5 días.
• Detección molecular (PCR) de cepas de C. tetani y cepas toxigénicas: 24 a 48 horas.
• Detección de la toxina tetánica libre por inoculación en ratones (MIT): 7 días.
• Detección de la toxina tetánica por inoculación en ratones y confirmación mediante la prueba de neutralización: 14 días.

Coste de la prueba:  

• Aislamiento en cultivo anaerobiosis: consultar a ivami@ivami.com.
• Cultivo y confirmación de la identificación de las colonias aisladas por PCR: consultar a ivami@ivami.com.
• Detección molecular (PCR) de cepas de C. tetani: consultar a ivami@ivami.com.
• Detección molecular (PCR) de cepas de C. tetani toxigénicas: consultar a ivami@ivami.com.
• Detección de la toxina tetánica por inoculación en ratones (MIT): consultar a ivami@ivami.com.
• Detección de la toxina tetánica por inoculación en ratones y confirmación mediante la prueba de neutralización: consultar a ivami@ivami.com.