Bacillus cereus – Cultivo cualitativo y cuantitativo, identificación, detección de toxina emética y de toxinas diarreicas. 

Bacillus cereus es una bacteria ubicuitaria de la familia Bacillaceae que incluye a bacterias grampositivas de forma bacilar, voluminosas y esporuladas, con espora elipsoidal central o subterminal. Esta bacteria se encuentra frecuentemente en el suelo, polvo, vegetales, cereales, harinas, especias, plantas medicinales, aguas naturales, y en algunos alimentos crudos o procesados, como platos a base de arroz, como el arroz frito, a base de pastas, a base de productos cárnicos como pollo o productos lácteos, entre otros.

Esta especie actualmente se considera un grupo (grupo Bacillus cereus) en el que se incluyen seis especies B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. pseudomycoides y B. weihenstephanensis. Algunas de estas especies son móviles por flagelos perítricos, pero otras son inmóviles, e incluso en las especies consideradas móviles existen variantes inmóviles, por lo que esta característica no puede condicionar su identificación. Son bacterias aerobias-anaerobias facultativas, grampositiva aunque en cultivos envejecidos, la coloración de Gram puede ser variable, como ocurre con B. cereus. Desde el punto de vista metabólico posee catalasa, reducen los nitratos a nitritos, da la reacción de Voges Proskauer, fermenta la glucosa, la sacarosa, la salicina y el glicerol, no fermenta el manitol, ni la arabinosa y produce lecitinasa. Las características de la producción de lecitinasa y la ausencia de fermentación del manitol se utilizan para el diseño de algunos medios selectivo diferenciales.

B. cereus puede producir enterotoxinas. La intoxicación alimentaria por esta bacteria puede ocurrir cuando se prepara el alimento y se conserva sin la refrigeración adecuada durante varias horas antes de su consumo u alcanza una concentración de >105 a 108 UFC/g o por mL. Ente los alimentos que se han implicado en brotes se incluyen las carnes cocinadas y los vegetales, el arroz hervido o frito, salsas de vainilla, natillas, sopas, y brotes de vegetales crudos. El consumo de alimentos contaminados con Bacillus cereus se ha implicado en dos tipos de manifestaciones: 1) la primera y mejor conocida, el síndrome diarreico, caracterizado por dolor abdominal y diarrea acuosa no-sanguinolenta, tras un periodo de incubación de 8 a 16 horas tras la ingestión de un alimento contaminado, con una duración de las manifestaciones de 12 a 24 horas; 2) la segunda, el síndrome emético, caracterizado por una manifestación aguda con nauseas y vómitos, que aparece después de 1 a 5 horas del consumo del alimento contaminado, y la ausencia generalmente de diarrea. Ambos síndromes son debidos a la producción de exotoxinas por B. cereus , y en general son procesos leves, aunque se han descrito casos que han requerido hospitalización, e incluso se ha descrito algún caso con fallecimiento.

El síndrome diarreico está causado por tres enterotoxinas termolábiles, por lo que este síndrome requiere la ingesta de alimentos contaminados con esporas, que una vez en el intestino delgado germinarán y liberarán las enterotoxinas durante su crecimiento. Las enterotoxinas descritas en Bacillus cereus son: dos complejos proteicos de hemolisina BL (HBL) y de enterotoxina no hemolítica (NHE: Non-hemolytic enterotoxin); por la citotoxina K (CytK), o por la enterotoxina FM (EntFM).

Algunas de estas enterotoxinas se han descrito en otras especies de Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus mojavensis y Bacillus fusiformis), por lo que debe tenerse en cuenta ante la ausencia de Bacillus cereus, y la presencia de alguna otra especie.

El síndrome emético está causa por una toxina termoestable, denominada cereulide que corresponde a un péptido cíclico no ribosómico (D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val)3, codificado por el gen ces de la sintetasa peptídica no-ribosómica (Non-ribosomal peptide synthetase gene). Esta toxina se ingiere preformada en alimento, y es tóxica para las mitocondrias al actuar como un ionóforo (captador y transportador) para iones potasio. 

Para que Bacillus cereus provoque estos síndromes se requiere que:

    • el alimento esté muy contaminado (concentraciones de l06 a 108 UFC/g o mL). 
    • el alimento haya sido sometido a un tratamiento térmico insuficiente para destruir sus esporas.

Para detectar su presencia y realizar su recuento deben utilizarse medios de cultivo que contengan inhibidores para impedir el desarrollo de otros microorganismos presentes en la muestra y que evidencien alguna característica diferencial como la lecitinasa y la ausencia de fermentación del manitol. Ejemplos de estos medios de cultivo son el agar MYP (Mannitol-Egg Yolk-Polymixin Agar; Agar MYPA) de Mossel que ha sido considerado el medio estándar, aunque con escasa selectividad, por lo que no inhibe totalmente la flora acompañante y puede enmascarse el desarrollo de B. cereus. Para poderlo detectar se requiere al menos la presencia de 10 UFC/g o por mL de B. cereus. Otros autores recomiendan el medio de Bacara que es un medio cromogénico selectivo y diferencial que facilita el crecimiento e identificación de B. cereus, inhibiendo el crecimiento de la flora acompañante. Las colonias aparecen de color rosa-naranja rodeadas de una zona de precipitación por la actividad lecitinasa sobre la lecitina contenida en el medio de cultivo. Para poder identificar la especie Bacillus cereus se requiere establecer un diagnóstico diferencial, utilizando varias pruebas metabólicos que identifique cada especie del grupo Bacillus cereus: B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, y B. weihenstephanensis.

El síndrome diarreico está mediado por varias exotoxinas, codificadas por distintos  genes. Para detectar la producción de exotoxinas se utilizaron cultivos celulares que eran expuestos a los sobrenadantes de los cultivos de Bacillus cereus. Sin embargo, hoy día se han desarrollado métodos de amplificación génómica (PCR) para detectar los genes productores de estas toxinas una vez que se ha obtenido un aislado de Bacillus cereus. También se han desarrollado pruebas (kits) comerciales para detectar las toxinas, pero todas tienen el problema de estar basadas en una reacción antígeno-anticuerpo utilizando antcuerpos que reaccionan con toxina proteica. Al existir varias toxinas diferentes, los kits existentes no detectan todas, por lo que su sensibilidad no es completa.

Métodos celulares: para detectar las toxinas a través del efecto lesivo que provocan en cultivos celulares in vitro, se han utilizado los siguientes: cultivo de células McCoy, cultivos de células CHO (Chinesse Hamster Ovary), cultivos de células Hep-2. En los culivos celulares se produce un efecto citopático sobre su proliferación o vacuolización.

Métodos inmunológicos: las pruebas (kits) comerciales para detectar la enterotoxina de Bacillus cereus no tienen buena aceptación ya que no identifican la toxina detectada. El kit de Oxoid (Bacillus cereus Enterotoxin-Reverse Passive Latex Agglutination –RPLA) detecta el componente L2 de la hemolisina BL, y el kit Tecra (Bacillus diarrhoeal Enterotroxin Visual Immunoassay) aparentemente detecta dos proteínas no tóxicas.

Métodos moleculares: cada una de las enterotoxinas estaría constituida por varias subunidades que a su vez son codificadas por genes distintos. De ahí que para poder realizar un estudio completo habría que detectar cada uno de los genes que pueden elaborar los distintos componentes ya que se han encontrado cepas en los que no se detectan todos los genes de cada una de las toxinas. Estos genes son:

    • Complejo HBL (enterotoxina hemolítica). Esta toxina es una hemolisina de tres componentes (proteína de fijación B –binding- codificada por gen hblA, y components líticos L1 y L2 codificados por genes hblC y hblD, respectivamente):
      • Gen hblA
      • Gen hblB
      • Gen hblC
      • Gern hblD
    • Complejo NHE (enterotoxina no hemolítica), con tres componentes, ninguno de ellos hemolítico:
      • Gen nheA
      • Gen nheB
      • Gen nheC
    • Citotoxina K (cytK)
    • Enterotoxina FM (EntFM)
    • Enterotoxina T
      • Gen bceT

Pruebas realizadas en IVAMI:

  • Cultivo cualitativo en medios de cultivo líquido y posterior siembra en placas de medio de cultivo selectivo diferencial
  • Cultivo cuantitativo en medio de cultivo selectivo diferencial
  • Identificación de la especie Bacillus cereus mediante secuenciación del gen 16S rRNA.
  • Detección de genes codificantes de las toxinas implicadas en el síndrome emético y en el síndrome diarreico.
  • Cereulide (gen ces de la sintetasa peptídica no-ribosómica).
  • Enterotoxina HBL (enterotoxina hemolítica)
    • Gen hblC para detectar componente L1.
  • Enterotoxina NHE (enterotoxina no-hemolítica)
    • Gen nheB para detectar el componente B.
  • Citotoxina K (cytK)
  • Enterotoxina FM (EntFM)
  • Enterotoxina T
    • Gen bceT.

Muestra recomendada:

 

  • Cualquier tipo de alimento sospechoso de haber provocado una intoxicación, tanto fresco (sin cocinar), como cocinado.

Conservación y envío de la muestra:

 

  • Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
  • Congelada: más de 2 días.

 

Plazo de entrega:

 

  • Cultivo para aislamiento: 48 a 72 horas.
  • PCR para dianas moleculares: 48 horas.

 

Coste de la prueba: