Bacillus subtilis (grupo de especies Bacillus subtilis): cultivo cualitativo y cuantitativo, identificación y detección de toxinas 

Bacillus subtilis se considera un grupo de bacterias muy similares (Grupo Bacillus subtilis), que incluiría a las siguientes especies: Bacillus subtilis sensu stricto, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. atrophaeus, B. vallismortis, B. pumilus, B. donorensis, B. mojavensis, B. axarquiensis, B. malacitensis, B. tequilensis, y B. venezuelensis). Este grupo de bacterias grampositivas, aerobias y formadoras de esporas, es muy ubicuitario (agua, suelo en sus capas superiores, sedimentos acuáticos, aire, residuos vegetales, tracto digestivo de animales y personas, …). En las personas han llegado a encontrarse en concentraciones de hasta 104 esporas/gramo, que parece demasiado abundante como para proceder de su ingestión y más bien indicaría que se encontraría multiplicándose en el tubo digestivo. Las especies pueden ser difíciles de diferenciar porque existen muy pocas características fenotípicas o bioquímicas que los diferencien. Por otra parte la mayoría de estas especies poseen una elevada homología en el gen del 16S rRNA, a veces superior al 99%, por lo que la secuenciación de este gen tampoco permite diferenciarlas. Únicamente los métodos de hibridación ADN-ADN permiten encontrar homologías inferiores al 70%, por las diferencias existentes en otras regiones genómicas, lo que ha hecho que algunos autores han recomendado el análisis filogenético de varios locus genéticos (multilocus) para diferenciarlas. La especie Bacillus subtilis sensu stricto tiene una homología del 72% con Bacillus cereus. Una de las diferencias de estas varias especies con Bacillus cereus es su incapacidad para desarrollarse por debajo de 10ºC, mientras que Bacillus cereus si lo puede hacer.

Al ser bacterias muy ubicuitarias, y encontrarse en las capas superiores del suelo y en el tubo digestivo de los animales, es relativamente fácil que contamine alimentos frescos, principalmente aquellos que pueden tomar contacto con el suelo, y en los de origen vegetal. Además pueden contaminar productos lácteos, carnes, alimentos infantiles, platos de arroz, especias y cereales). Sus esporas pueden sobrevivir a la cocción, a los procedimientos de pasteurización láctea o de los zumos de frutas, y a la preparación de comidas caseras, por lo que sus esporas pueden germinar después y multiplicarse en forma vegetativa cuando las condiciones ambientales le son propicias.

En general, se consideran especies no patógenas, y se han utilizado como probióticos en individuos sanos. Sin embargo, se han descrito casos aislados o agrupados en brotes con  manifestaciones digestivas, como gastroenteritis, debidos al consumo de alimentos en los que han proliferado, y atribuidos a la ingestión de una toxina preformada en el alimento (síndrome emético), o a la generación de la toxina a nivel digestivo (síndrome diarreico). No obstante, la información sobre las intoxicaciones alimentarias por especies del grupo Bacillus subtilis son escasas, y sólo se ha descrito implicado en algunos brotes ocasionales. Algunas de estas especies se han encontrado en infecciones de pacientes inmunodeprimidos.

En relación con los alimentos, los brotes de intoxicación alimentaria atribuibles a este grupo de especies también han sido muy ocasionales. Se ha descrito la producción de una toxina extracelular, la subtilina (Bacillus subtilis) de escasa toxigenicidad y únicamente relacionada con el desarrollo de reacciones alérgicas en individuos que trabajan con cultivos industriales de esta especie. Además, se ha descrito la producción de una toxina proteica termoestable, la amilosina, (Bacillus amyloliquefaciens), que sería formadora de canales de iones en las membranas celulares. Otras toxinas serían unos lipopéptidos termoestables como la lichepysina A (Bacillus licheniformis) descrita en un caso fatal; la pumilacidina (Bacillus pumilus) en un caso grave de intoxicación alimentaria; y la surfactina B (Bacillus mojavensis y Bacillus subtilis)

Los síntomas de la intoxicación alimentaria por Bacillus subtilis son muy similares a los provocados por la intoxicación por Bacillus cereus, causante de un cuadro diarreico y emético, el primero de ellos relacionado con el número de bacterias ingeridas, y el segundo relacionado con la cantidad de toxina emética ingerida. El comienzo de la sintomatología podrían ser tan pronto como a los 10 minutos de la ingestión, y podrían durar hasta 2 días. Su relación con la producción de cuadros de intoxicación alimentaria se produciría cuando se alcanza una concentración de 106 UFC/gramo de alimento (para otras especies de Bacillus, como Bacillus cereus sería suficiente con alcanzar el número de 105 células/gramo). 

Métodos de diagnóstico

El diagnóstico de los casos de intoxicacón alimentaria se basa en la detección cualitativa, y mejor aun, cuantitativa, de su presencia mediante métodos de cultivo de enriquecimiento (cultivo cualitativo), y de recuento (cultivo cuantitativo), de identificación y en la detección de su capacidad toxigénica.

 

Métodos de cultivo cualitativo y cuantitativo: estos métodos tienen como objetivo demostrar su presencia, y su concentraciones, ya que cuando tiene implicaciones en intoxicaciones alimentarias debe encontrarse en concentración igual o superior a 106 UFC/mL o por gramo. 

Detección de la capacidad toxigénica: pueden utilizarse varios tipos de métodos para detectar la producción de toxinas por este grupo de bacterias.

  • Métodos con cultivos celulares: los cultivos celulares de células Hep-2 y de células CHO (Chinese Hamster Ovary), se han utilizado para poner en evidencia la presencia de estas toxinas en filtrados de cultivos de estas bacterias, mediante la detección del efecto producido en las células en cultivo al añadirle filtrados de cultivo de esta bacteria. El efecto se determina mediante la reducción de la actividad metabólica en los cultivos celulares expuestos a los filtrados que contienen la toxina.
  • Métodos basados de reacciones inmunológicas: estos métodos comercializados (kits), utilizan anticuerpos específicos frente a algunos de los componentes enterotóxicos que pueden producir estas bacterias. Al ser métodos que detectan uno u otro de los componentes enterotóxicos, puede fallar cuando la cepa aislada produce una enterotoxina distintas detectada por el kit utilizado. Existen publicaciones científicas que demuestran que sólo un 36% de los casos de los casos positivos por ensayos de citotoxicidad, lo son por ensayos inmunológicos (Beatie SH, Williams AG. Detection of toxigenic strains of Bacillus cereus and other Bacillus spp. with an improved citotoxicity assay. Lett Appl Microbiol. 1999, 28: 221-225).
  • Métodos moleculares: estos métodos detectan cualquiera de los genes codificantes de las enterotoxinas: enterotoxina hemolítica HBL (genes hblA, hblC, hblD); enterotoxina T (gen BceT), u otras. Las enterotoxinas producidas por especies de Bacillus corresponde a alguno de los siguientes tipos:
    • Complejo HBL (enterotoxina hemolítica). Está toxina es una hemolisina de tres componentes (proteína de fijación B –binding- codificada por gen hblA, y components líticos L1 y L2 codificados por genes hblC y hblD, respectivamente):
        • Gen hblA
        • Gen hblB
        • Gen hblC
        • Gern hblD
    • Complejo NHE (enterotoxina no hemolítica), con tres componentes, ninguno de ellos hemolítico:
        • Gen nheA
        • Gen nheB
        • Gen nheC
    • Citotoxina K (cytK)
    • Enterotoxina FM (EntFM)
    • Enterotoxina T
        • Gen bceT 

Pruebas realizadas en IVAMI:

  • Cultivo cualitativo en medios de cultivo líquido y posterior siembra en placas de medio de cultivo selectivo diferencial
  • Cultivo cuantitativo en medio de cultivo selectivo diferencial
  • Identificación del grupo de especies Bacillus subtilis mediante secuenciación del gen de 16S rRNA.
  • Detección de genes codificantes de las toxinas implicadas en el síndrome emético y en el síndrome diarreico, mediante amplificación por PCR de los correspondientes genes:
    • Cereulide (gen ces de la sintetasa peptídica no-ribosómica)
    • Enterotoxina HBL (enterotoxina hemolítica)
      • Gen hblC para detectar componente L1.
      • Enterotoxina NHE (enterotoxina no-hemolítica)
        • Gen nheB para detectar el componente B.
    • Citotoxina K (cytK)
    • Enterotoxina FM (EntFM)
    • Enterotoxina T
        • Gen bceT.
    • Detección de producción de toxinas por exposición de cultivos de células Hep-2 o de células CHO, a filtrados de cultivos, con ensayo de reducción de metiltetrazolio (MTT). 

Muestra recomendada:

 

  • Cualquier tipo de alimento sospechoso de haber provocado una intoxicación, tanto fresco (sin cocinar), como cocinado. 

Conservación y envío de la muestra:

  • Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
  • Congelada: más de 2 días. 

Plazo de entrega:

 

  • Cultivo para aislamiento: 48 a 72 horas.
  • Identificación molecular con secuenciación: 48 horas
  • Detección de genes productores de toxinas por PCR: 48 horas.
  • Detección de la producción de toxinas por exposición de filtrados de cultivos a cultvos celulares: 5 días. 

Coste de las pruebas: