Norovirus y Sapovirus (Caliciviridae). Detección por PCR en tiempo real (Virus similares al virus Norwalk y al virus Sapporo) Método basado en norma ISO 15216-2.

Los Norovirus son unos virus muy contagiosos, implicados en el 60 a 95% de las gastroenteritis producidas por virus, y éstas, a su vez, son la principal causa (80%) de las gastroenteritis.

El virus Norwalk y otros virus similares, pertenecen a la misma familia (Caliciviridae). Estos virus fueron denominados “Norwalk-like viruses”, por haber sido encontrados por primera vez en 1968 como causa de un brote epidémico de gastroenteritis en la ciudad de Norwalk (Ohio, USA). Posteriormente, se fueron describiendo otros brotes, algunos muy parecidos filogenéticamente al virus Norwalk, y otros muy parecidos a otro virus de esta familia, descrito en la ciudad de Sapporo en Japón en 1977, y que se denominó Sapporovirus. Actualmente, estos virus productores de gastroenteritis, se clasifican en 4 géneros, dos de ellos con especies que afectan al hombre (Norovirus y Sapovirus), y otros dos que afectan únicamente a animales (Lagovirus y Vesivirus). Los Norovirus se diferencian en dos genogrupos, y dentro de cada uno de ellos pueden diferenciarse grupos filogenéticos (clusters).

Entre estos virus se encuentran:

Norovirus (NLVs: Norwalk-like viruses)

                        Genogrupo I

            • Norwalk virus (prototipo: Norwalk/68/US)
            • Southampton virus
            • Desert Shield virus
            • Cruise ship virus
            • .......   

                        Genogrupo II

            • Snow Mountain agent (prototipo: Snow Mountain/76/US)
            • Hawaii virus
            • Mexico virus
            • Toronto virus
            • Lordsdale virus
            • Grimsby virus
            • Gwynedd virus
            • White river virus
            • .......

Sapovirus  (SLVs: Sapporo-like viruses)

            • Sapporo virus
            • Manchester virus
            • Parkville virus
            • London virus
            • ……. 

Infecciones por Caliciviridae 

Los Norovirus son unos virus muy contagiosos, la principal causa de gastroenteritis no bacteriana en niños mayores (30%) y adultos (50%). Son la principal causa de brotes agudos de gastroenteritis en hospitales, residencias de personas mayores y guarderías infantiles. Así mismo producen brotes de gastroenteritis en hoteles, cruceros.

Tras un periodo de incubación corto (12 a 48 horas) se produce una gastroenteritis caracterizada por predominio de vómitos y dolor abdominal, junto con diarrea acuosa no sanguinolenta. Pueden existir cefaleas y fiebre moderada. El proceso es autolimitado y dura entre 1 y 3 días, excepto en niños pequeños, ancianos y pacientes hospitalizados que puede durar 4 a 6 días. Los virus se eliminan con las heces durante más tiempo (hasta 2 semanas o incluso más tiempo). La concentración de virus en heces puede ser de 103 a 106 partículas por mL. La infectividad de los afectados es muy elevada, ya que la dosis mínima infectante puede ser baja (10 a 100 viriones).

En los afectados se recomienda beber muchos líquidos para evitar la deshidratación, lavarse las manos con frecuencia con jabón y agua durante al menos 20 segundos, especialmente después de ir al baño, y antes de preparar comidas. En los trabajadores de restaurantes debe evitarse cocinar, preparar o servir alimentos. Deben desinfectarse superficies contaminadas con vómitos o diarreas con productos que contengan lejía. Se recomienda lavar las frutas, vegetales y cocinar moluscos bivalvos (principalmente cuidado con las ostras) antes de consumir.  

Transmisión de Caliciviridae 

El reservorio es estrictamente humano, y su principal mecanismo de transmisión es por contacto directo o vía fecal-oral, de forma que las personas infectadas extienden el virus directamente a otras personas, o pueden contaminar alimentos o bebidas que preparan para otras personas. El virus también puede contaminar superficies, y sobrevivir en ellas, contaminando los alimentos que se preparen. Se ha señalado la vía aerógena cuando se consideran las pequeñas salpicaduras que pueden generarse durante el vómito, pero es discutida. En muchos casos está relacionado con el consumo de ostras, agua contaminado o hielo fabricado con agua contaminada.

En septiembre de 2012 se produjo un brote enorme de gastroenteritis en Alemania en varios colegios y guarderías de varios estados federales (Berlín, Brandenburg, Saxony, Saxony-Anhalt, y Thuringia, que afectó a más de 11.000 niños y jóvenes que tuvieron vómitos y diarreas. El brote fue debido a la ingestión de frambuesas congeladas, algunas consumidas si ningún procesamiento,  otras con calentamiento breve y azucaradas.

El tiempo de calentamiento para inactivar Norovirus humanos no se conoce perfectamente, por la imposibilidad de realizar pruebas de tratamiento térmico e infectividad, al no poderse cultivar el virus en el laboratorio, pero se piensa que un calentamiento a 60ºC durante 30 minutos no lo inactiva completamente. Si se quiere inactivar completamente, sería necesario alcanzar 90ºC y/o mantener más tiempo con temperatura superior a 70ºC. Se han realizado estudios experimentales para conocer la inactivación utilizando otros virus similares de animales (FCV: Feline Calicivirus; CaCV: Canine Calicivirus; MNV: Murine Norovirus), llegándose a concluir que 70ºC durante 1 minuto reduce en 3 log el número de viriones infectantes; 70ºC durante 15 segundos reduce 1 log; 70ºC durante 5 minutos reduce 7,5 log, etc.

La acción de los desinfectantes virucidas frente a Norovirus humanos, no se conoce exactamente por no poder cultivarse y realizar pruebas con él. Las evaluaciones utilizando el virus FCV (Feline Calicivirus), han demostrado que es muy resistente a los desinfectantes comercializados con actividad virucida, y que los desinfectantes fenólicos utilizados a 2 ó 4 veces la concentración recomendada para descontaminar superficies, puede controlar los brotes provocados por Norovirus en restaurantes. En frambuesas y lechugas ,el ácido peroxiacético y peróxido de hidrógeno, cuando se utiliza a 4 veces la concentración recomendada por el fabricante durante 10 minutos, es efectiva. También se ha demostrado que el lavado con agua de las frutas o verduras reduce la cantidad de virus en 2 log. Los resultados de la evaluación de desinfectantes sugieren que estos virus son muy resistentes a los desinfectantes comerciales.

Diagnóstico de las infecciones por Caliciviridae

Este virus no puede cultivarse en cultivos celulares, por lo que las únicas alternativas posibles son:

        • Detección de virus en muestras fecales mediante observación de purificado de heces por microscopía electrónica. Escasa sensibilidad (50%).
        • Detección de antígeno vírico mediantes reacción inmunoenzimática mediante varios tipos de formatos (ELISA o inmunocromatografía). En general baja sensibilidad (35%).
        • Detección de su ácido nucleico (ARN). Esta prueba se considera la más sensible (98%).

Pruebas realizadas en IVAMI

        • PCR en tiempo real, siguiendo las directrices de la noma ISO 15216-2, y comprobación por secuenciación para su identificación, en caso de obtenerse un resultado positivo. 

Tipo de muestras y volumen/cantidad de muestras

        • Aguas de bebida o de otro tipo (5 litros).
        • Heces (10 mL o g).
        • Vómitos (10 mL o g).
        • Alimentos (100 mL o 100 g; para frutos rojos, muestra adecuada para lavar al menos 100 g).
        • Torundas impregnadas en superficies (torundas humedecidas y pasadas por las superficies sospechosas).

Conservación de las muestras: por tratarse de virus ARN debe conservarse congelada, o al menos refrigerada el menor tiempo posible, evitando congelaciones repetidas en caso de congelarse. 

Transporte: congelado o refrigerado, sin romperse la cadena de frío.

Plazo de entrega de resultados       

Las muestras comienzan a procesarse cuando se reciben, y los resultados se emiten en el menor tiempo posible que permiten los tiempos de realización. Para las pruebas de Microbiología Molecular el tiempo es de 24 a 72 horas, según hubiese que secuenciar o no. Si disponemos antes de los resultados se lo comunicaríamos. 

Coste de la prueba:

    • Prueba de PCR en tiempo real sin secuenciación: Consultar a ivami@ivami.com.
    • Prueba de PCR positiva, seguida de secuenciación para diferenciar Norovirus y Sapovirus (sólo en caso de ser positiva la PCR y solicitar identificación): consultar a ivami@ivami.com.