Clostridium botulinum – Pruebas para diagnóstico de botulismo: Información general.

Información 05-08-16.

Pruebas para diagnóstico de botulismo

Detección de la toxina botulínica en las muestras/productos sin cultivo previo (para muestras recomendadas ver después en el apartado de pruebas ofertadas por IVAMI  y muestras requeridas).

Esta es la prueba recomendada en un paciente con clínica de botulismo.

La detección de la toxina botulínica preformada puede llevarse a cabo en un líquido como el suero obtenido a partir de sangre. También puede detectarse a partir de los restos de un alimento ingerido que haya causado un caso/brote de botulismo, preparando un extracto filtrado a partir de él. En los casos de botulismo infantil o de botulismo intestinal puede detectarse la presencia de toxina botulínica en las heces de los niños/pacientes, pero consideramos más recomendable realizar un cultivo previo de las heces (ver después). Para detectar la toxina se lleva a cabo la inoculación de animales de experimentación (ratones) que desarrollarán una sintomatología paralítica, seguida de muerte, si se les inoculó toxina botulínica. Para corroborar que los ratones han muerto por la inoculación de toxina botulínica, es necesario realizar una prueba de neutralización, que permite confirmar que existe toxina botulínica y al mismo tiempo permite identificar el tipo de toxina botulínica presente. Esta prueba de neutralización se realiza enfrentando el producto inoculado (suero de persona o animal, extracto de alimento ingerido, …) a antisueros específicos de cada tipo de toxina.

Como paso previo a la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis mínima mortal (d.m.m.). De esta forma calcularemos la dilución máxima (la más elevada) que provoca la muerte de los animales inoculados, y el volumen inoculado que ha provocado la muerte de los animales contendrá una dosis mínima mortal.

Para identificar el tipo de toxina, una vez titulada y conocida la “dosis mínima mortal”, se realizará el enfrentamiento de una dosis mínima mortal con los distintos tipos de sueros anti-botulínicos. Estas mezclas serán inoculadas en igual volumen a los animales de experimentación y aquellos que sobrevivan, habrán sido inoculados con la mezcla de “dosis mínima mortal” más un antisuero frente a un tipo que ha sido capaz de neutralizarlo.

Detección de la toxina en las muestras/productos tras cultivo previo (para muestras recomendadas ver después en el apartado de pruebas ofertadas por IVAMI  y muestras requeridas).

Cuando la bacteria Clostridium botulinum, productora de la toxina, pueda encontrarse en la muestra se recomienda realizar el cultivo previo, para investigar la toxina después de haber cultivado la muestra. Este es el caso de las heces de un paciente afecto de botulismo infantil o de botulismo intestinal, de los restos de un alimento ingerido en el que hubiese proliferado la bacteria (por ej., una conserva), de un alimento sospechoso que pudiese contener la bacteria proliferando (por ej., una conserva abombada), un alimento sometido a control en el se desee excluir la presencia de esta bacteria (por ej., embutidos como jamones),  o de otras muestras como los lodos acuáticos o marinos, etc., de zonas donde se haya observado mortalidad de las aves acuáticas.

Durante el cultivo en el laboratorio, en los medios de cultivo adecuados, se produce la toxina en caso de que exista la bacteria y al preparar un filtrado del cultivo se puede investigar su presencia, inoculando con el filtrado a ratones, que en caso de afectarse indicará la presencia probable de Clostridium botulinum en la muestra/producto cultivado. No obstante, los ratones pueden haber fallecido por otra causa, por lo que es necesario, antes de emitir el informe, comprobar que realmente han fallecido por haberles inoculado toxina botulínica.

Para confirmar la presencia de toxina botulínica en el cultivo se puede realizar la prueba de neutralización utilizando antisueros específicos de cada tipo de toxina botulínica (prueba de neutralización), o bien detectar la presencia de Clostridium botulínum y su tipo en el medio de cultivo (detección molecular por PCR).

La prueba de neutralización se realiza enfrentando el producto inoculado (filtrado de cultivo) a antisueros específicos de cada tipo de toxina.

Como paso previo a la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis mínima mortal (d.m.m.). De esta forma se calcula la dilución máxima (la más elevada) que provoca la muerte de los animales inoculados, y el volumen inoculado que ha provocado la muerte de los animales contendrá una dosis mínima mortal.

Para identificar el tipo de toxina, una vez titulada y conocida la “dosis mínima mortal”, se realizará el enfrentamiento de una dosis mínima mortal con los distintos tipos de sueros anti-botulínicos. Estas mezclas serán inoculadas en igual volumen a los animales de experimentación y aquellos que sobrevivan, habrán sido inoculados con la mezcla de “dosis mínima mortal” más un antisuero frente a un tipo que ha sido capaz de neutralizarlo.

La detección molecular por PCR evita el tiempo requerido para calcular la dosis mínima  mortal (d.m.m.) y la prueba de neutralización.

Detección de anticuerpos anti-toxina botulínica (para muestras recomendadas ver después en el apartado de pruebas ofertadas por IVAMI  y muestras requeridas)

La detección de anticuerpos anti-toxina botulínica tiene interés en los siguientes casos:

• Pacientes en tratamiento con toxina botulínica diluida, como los que reciben bótox para tratamientos estéticos o médicos (ej. dolor facial por neuralgia del trigémino), para detectar la presencia de anticuerpos que puedan impedir su acción.

• Pacientes con sospecha de botulismo infantil o botulismo del adulto en los que no se haya podido encontrar la bacteria Clostridium botulinum o su toxina en heces, ni la toxina en suero.

• Individuos vacunados en los que interese comprobar el estado de protección.

La toxina de Clostridium botulinum, a diluciones muy elevadas, se ha usado mediante administración local para tratar procesos espásticos. En estos procesos se ha demostrado que puede ser un remedio útil. Estos procesos espásticos suelen ser crónicos por lo que requieren que se administre la toxina de forma duradera. Por ello, pueden surgir  resistencias durante el tratamiento debido a la inmunización progresiva del paciente a lo largo del tratamiento, en cuyo caso el remedio sería limitado. Para detectar esta inmunización se requiere medir de forma precisa y sensible la existencia de anticuerpos frente a la toxina botulínica A y/o B.

El método de referencia aceptado para detectar y cuantificar los anticuerpos frente a la toxina botulínica es la prueba de neutralización en ratón (Mouse Neutralization Assay), en el que una solución de la toxina botulínica, cuantificada en Dosis Letal 50% para el ratón (DL₅₀), se mezcla con varias diluciones en base 2 ó en base 4 del suero/plasma problema, y tras una incubación se inocula por vía intraperitoneal a unos lotes de ratones. La dilución más elevada del suero problema que reduzca la toxicidad es el título de anticuerpos frente a la correspondiente toxina botulínica del suero. Esta dilución, comparada con un standard internacional permite obtener los resultados en unidades internaciones (UI/mL) (1 U.I. se define como la cantidad de anticuerpos que neutraliza 10.000 DL₅₀ de toxinas A o B, o 1.000 DL₅₀ del tipo E). La cantidad de toxina utilizada en las pruebas es aquella que es neutralizada por 0,02; 0,005 y 0,0125 UI/mL de antitoxina para los tipos A, B y E, respectivamente (Hatheway et al. 1984). Los sueros que no protegen al ratón al título de 1:4 se informan como <0,08 UI/mL para el tipo A, o <0,02 UI/mL para el tipo B. Esta prueba es laboriosa, costosa y de larga duración de realización, por lo que se han buscado alternativas basadas en métodos de enmzimoinmunoanálisis (ELISA) utilizando microplacas recubiertas de toxina botulínica. Sin embargo, los valores obtenidos por ELISA, a veces, no se correlacionan completamente con la prueba de neutralización en ratón.

Como paso previo a la prueba de neutralización es necesario calcular la dosis mínima mortal (d.m.m.) de toxina. El cálculo de la dosis mínima mortal se realiza diluyendo en base 10 el filtrado de un cultivo, diluyendo a la mitad con solución salina fisiológica para obtener la misma dilución que la toxina mezclada con suero o plasma de paciente, e inoculando con cada mezcla de dilución unos animales de laboratorio. De esta forma se calcula la dilución máxima (la más elevada) que provoca la muerte de los animales inoculados. El volumen inoculado que ha provocado la muerte de los animales contendrá una dosis mínima mortal.

Una vez conocida la dosis mínima mortal, hay que calcular la dosis mínima no mortal (d.m.n.m.) que corresponde a la cantidad mínima de toxina que en presencia de una cantidad constante de antitoxina, no provoca la muerte de los ratones inoculados. Esta cantidad de toxina es la que es neutralizada por las unidades correspondientes de antiotoxina anti-A, o de antitoxina anti B. Se llama dosis mínima no mortal porque es la mínima cantidad de toxina  que no provoca la muerte de los ratones en presencia de antitoxina.