In vitro Skin irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method –RhE- (OECD 439: 2010 standard guideline)

[Irritación cutánea in vitro con método de epidermis humana reconstruida (In vitro Skin irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method –RhE-) (norma OECD 439: 2010)] 

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La irritación cutánea indica un daño irreversible en la piel después de la aplicación de una sustancia química hasta durante 4 horas. La evaluación de la irritación cutánea se ha evaluado con animales de experimentación. Sin embargo, para proteger el bienestar animal su uso debe limitarse, estando prohibido desde hace unos años para evaluar productos cosméticos. Esta norma proporciona un procedimiento in vitro que puede utilizarse para evaluar la capacidad irritante cutánea de sustancias aisladas o de mezclas de ellas, utilizando un modelo experimental de epidermis humana reconstruida (RhE: Reconstructed Human Epidermis). Este modelo simula las propiedades bioquímicas y fisiológicas de las capas  superiores de la piel humana, es decir la epidermis, utilizando como células queratinocitos epidérmicos humanos no transformados, que se adaptan in vitro para formar un tejido equivalente en su citoarquitectura a la piel humana. El modelo RhE utiliza queratinocitos humanos que representan el órgano diana in vitro. Además, implica el paso inicial de la cascada inflamatoria/mecanismo de acción (daño celular y daño tisular resultante del trauma localizado), que ocurre durante la irritación in vivo en animales de experimentación. La prueba puede aplicarse a sustancias sólidas, líquidas, semisólidas y ceras. Los líquidos pueden ser acuosos o no-acuosos; los sólidos pueden ser solubles o insolubles en agua. Cuando sea posible los sólidos deben ser molidos a polvo fino antes de la aplicación y no se requiere ningún otro pretratamiento de la muestra antes de la aplicación. Este método tiene la limitación de que las sustancias químicas muy coloreadas pueden interferir con las medidas de la viabilidad celular, en las que también se utiliza una sustancia cromógena. Para la evaluación puede ser suficiente con tres réplicas cuando los resultados de la prueba permiten una clasificación inequívoca, pero sin embargo, en los casos de situaciones límites, como ocurre cuando no existe concordancia entre las réplicas y/o porcentajes de viabilidad iguales a 50 ± 5%, debe realizarse una segunda repetición, o incluso una tercera, en caso de haberse obtenido resultados discordantes entre las dos primeras series.

 

En la prueba, la sustancia sometida a ensayo se aplica directamente en forma tópica al modelo tridimensional de RhE. Este modelo está constituido por queratinocitos epidérmicos humanos no-transformados, que han sido cultivados para formar un modelo multicapa altamente diferenciado de epidermis humana. El modelo RhE está compuesto de abajo arriba por la capa basal, la capa espinosa (stratum spinosum), la capa granular (stratum granulosum), y el estrato corneo (stratum corneum), que contiene los lípidos intercelulares  análogos a los lípidos encontrados in vivo.

 

La irritación cutánea inducida por sustancias químicas se manifiesta clínicamente por generar eritema y edema, como resultado de una cascada de eventos que comienzan con la penetración del stratum corneum, dañando a continuación las capas subyacentes de queratinocitos. Los queratinocitos moribundos liberan mediadores que inician la cascada inflamatoria, liberando citoquinas que actúan sobre las células de la dermis, particularmente las células del estroma y endoteliales. El aumento de la permeabilidad de las células endoteliales provocan el eritema y edema observados clínicamente. Los métodos in vitro basados en modelos RhE miden las alteraciones inductoras de la cascada inflamatoria que se inicia cuando las sustancias químicas alteran la epidermis. La viabilidad celular de los modelos RhE se mide por la conversión enzimática del colorante vital MTT (bromuro de dimetil-difeniltetrazolio) en azul de formazán que puede medirse cuantitativamente después de extraerse del tejido. Las sustancias irritantes provocan una disminución de la viabilidad celular por debajo de un punto de corte definido (e. gr. ≤ 50% para  productos de categoría 2 UN GHS). Los productos que induzcan viabilidad celular por encima del nivel de corte pueden considerarse no-irritantes (e. gr. > 50%, no categoría de irritantes). 

 

Cantidad de muestra necesaria para las pruebas

El volumen de líquido de extraído preparado con el producto sanitario (dispositivo médico) sometido a ensayo, para realizar las pruebas es de 20 mL.

Para calcular la cantidad de muestra necesaria para preparar ese volumen de extraído, siguiendo las directrices de la norma UNE-EN ISO 10993, se requieren las siguientes cantidades del producto sanitario: 

  • Dispositivos médicos con superficies planas (guantes, láminas, tejido, etc.):

Superficie de un grosor < 0,5 mm, 6 cm2/mL; Para obtener 20 mL se requieren 120 cm2.

Superficie de un grosor entre 0,5-1 mm: 3 cm2/mL; Para obtener 20 mL se requieren 60 cm2.

Superficie de un grosor > 1 mm: 1,25 cm2/mL¸ Para obtener 20 mL se requieren 25 cm2.

  • Dispositivos sólidos de forma irregular: 0,2 gramos/mL¸ Para obtener 20 mL se requieren 4 gramos.
  • Dispositivos porosos irregulares: 0,1 gramos/mL¸ Para obtener 20 mL se requieren 2 gramos.

Multiplique el tamaño de la superficie o el peso indicado, según corresponda, por el número total de mililitros indicado, y sabrá la cantidad en cm2 o gramos necesarios para el ensayo.  

  • Productos hidrosolubles: para productos solubles (hidrosolubles, indicar la/s concentración/es, a las que se desea realizar la prueba). 

Formulario con características del producto y variables para las pruebas

En caso de solicitar la realización de las pruebas debe remitirnos con el producto el formulario correspondiente cumplimentado en el que se indicarán las características del producto y las variables, en su caso elegidas. 

Plazo de entrega de resultados       

Será aproximadamente de unos dos meses a partir de la recepción en nuestro laboratorio de la muestra y del formulario con las condiciones de la prueba. Si disponemos antes de los resultados se lo comunicaríamos. El tiempo está en función del tiempo que tardemos en disponer de la epidermis reconstruida a partir de los cultivos de queratinocitos. Estos cultivos se ponen en marcha cuando se solicita la prueba y son de crecimiento muy lento e igual ocurre con la generación del epitelio cutáneo. 

Coste de la prueba