Genotoxicidad del agua. Prueba in vitro de mutación de genes celulares de mamíferos  – OECD 476: 2016. In vitro mammalian cell gene mutation test using the Hprt and xprt genes.

Información 10-01-17.

Para realizar las pruebas de genotoxicidad pueden utilizarse varios tipos de pruebas in vitro, bien una serie de dos pruebas o de tres pruebas. Cuando se opte por la realización de tres pruebas éstas incluirán: una prueba para mutaciones génicas utilizando bacterias (OECD 471), una prueba para mutaciones génicas utilizando células de mamíferos (OECD 476), y una prueba de clastogenicidad utilizando células de mamíferos (OECD 473). Cuando se opte por la realización de dos pruebas, se requerirá una prueba para mutaciones génicas utilizando bacterias (OECD 471) y una prueba para mutaciones génicas utilizando células de mamíferos (OECD 476), pero en la que se realice la determinación del número de colonias y su tamaño con vistas a cubrir ambos tipos de objetivos (mutaciones génicas y clastogenicidad). Si los resultados de las pruebas in vitro son negativos no está indicado habitualmente realizar pruebas en animales.

La función primaria de las pruebas de genotoxicidad es investigar, utilizando células u organismos, el potencial de los productos ensayados para inducir cambios genéticos en humanos que puedan transmitirse a futuras generaciones. Los datos científicos apoyan en general la hipótesis de que los daños en el ADN de las células somáticas son críticos para el inicio del cáncer, por lo que estas pruebas pueden identificar sustancias químicas con potencial carcinogénico. Hasta donde conocemos, no existe un acuerdo internacional de cuál es la mejor combinación de pruebas para un fin concreto. Los métodos más recomendados son los descritos por las normas OECD 471 y OECD 476.

En la prueba OECD 476: 2016, in vitro de mutación de genes celulares de mamíferos (In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test using the Hprt gene), se detectan mutaciones génicas inducidas por sustancias químicas utilizando células eucariotas. Para la prueba HPRT, pueden utilizarse varios tipos de líneas celulares como las células CHO, CHL y V79 de células de hámster (Chinese hámster cells), las células L5178Y de linfoma de ratón, o las células TK6 (linfoblastoides humanas).

Las pruebas in vitro de mutaciones génicas de genes de células de mamíferos, utilizan líneas celulares establecidas. Estas células se han seleccionado basándose en su capacidad de crecimiento en cultivo y en su estabilidad génica en cuanto a la frecuencia de mutaciones espontáneas. Las pruebas in vitro pueden requerir el uso de un activador metabólico exógeno, aunque éste no puede simular completamente las condiciones in vivo. Deben evitarse condiciones que puedan no reflejar la mutagénesis intrínseca propia de las células, como podrían ser las variaciones en el pH, en osmolaridad, interacciones con componentes del medio de cultivo y citotoxicidad debida a altas concentraciones de la sustancia probada. Muchos compuestos para los que se detecta un potencial mutagénico con esta prueba son carcinógenos de mamíferos, pero no existe una correlación perfecta entre estos resultados y la carcinogenicidad.

Las células con Hprt (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase gene) (en la prueba HPRT), son sensibles a la acción de 6-tioguanina (6-thioguanine –TG-), por lo que no pueden desarrollarse en su presencia. Sin embargo, cuando mutan se seleccionan por su resistencia al análogo de nucleótido 6-tioguanina (6-thioguanine). Las mutaciones detectadas por la prueba HPRT pueden corresponder a sustituciones de nucleótidos, desplazamientos –frameshifts-, pequeñas deleciones o inserciones situadas en el cromosoma X.

Para realizar la prueba, la suspensión celular o los cultivos en monocapa, según el tipo de células utilizadas, se exponen a la sustancia de prueba, con y sin activación metabólica, durante un periodo de tiempo adecuado y se subcultivan para determinar si se han inhibido por incorporar los análogos de nucleótidos o si por el contrario no son inhibidas por haber mutado en presencia del análogo utilizado. La citotoxicidad se determina midiendo la eficiencia relativa de clonación (supervivencia) o el crecimiento total relativo de las células de un cultivo después del periodo de exposición. Las células tratadas se mantienen en medio de crecimiento durante un periodo de tiempo suficiente, característico para cada locus y tipo de células, para permitir la expresión fenotípica de las mutaciones inducidas.

La frecuencia de mutantes se determina sembrando un número conocido de células en medio con el agente selectivo para determina la presencia de las células mutadas, así como en un medio de cultivo sin el agente selectivo para determinar la eficiencia de clonación (viabilidad). Después de un periodo de tiempo se cuentan las colonias y la frecuencia de mutación se obtiene a partir del número de colonias de mutantes en medio selectivo y del número de colonias en medio no-selectivo. En la prueba deben utilizarse al menos 4 concentraciones analizables que en caso de existir citotoxicidad cubran un rango máximo con escasa o nula toxicidad, así como los controles positivos con sustancias conocidas capaces de inducir mutaciones, tanto en ausencia o en presencia de un activador metabólico exógeno. Las exposiciones deben realizarse entre 3 y 6 horas por duplicado, incluyendo los controles negativos por duplicado.

Tras la exposición al producto de ensayo, las células son cultivadas e incubadas durante un periodo de 7 a 9 días en medio de crecimiento celular, para ar tiempo a ,os cultivos a proliferar o no en función de la genotoxicidad de la sustancia de ensayo. Una vez transcurrido ese tiempo, a añadir el agente selectivo (6-tioguania), las células son cultivadas durante un periodo de 9 a 12 días para permitir el desarrollo del fenotipo mutante en caso de estar presente.