Ecotoxicidad - Plantas terrestres: Pruebas de germinación y de crecimiento de plántulas (OECD 208: 2006).
Esta prueba está diseñada para evaluar los efectos sobre la germinación de las plántulas y el crecimiento inicial de las plantas después de la exposición a la sustancia de prueba incorporada en la tierra (si la exposición a la sustancia química se produce a través del suelo y existe preocupación por la absorción por las raíces) o aplicada a la superficie de la tierra (en el caso de ensayar productos fitosanitarios).
Las semillas se colocan en contacto con el suelo tratado con la sustancia de prueba por uno de los dos métodos indicados (incorporación a la tierra o aplicación sobre la superficie) y se evalúan para determinar los efectos entre 14 y 21 días después de que se haya producido la germinación en el 50% de las plántulas en el grupo control, no expuesto al producto sometido a evaluación. Los criterios de evaluación son la observación visual de la germinación de las plántulas, las mediciones de biomasa (seca o húmeda) de las plantas, la altura de los brotes y los efectos perjudiciales visibles en diferentes partes de la planta.
Esta Norma no indica el número de especies a incluir en las pruebas, ya que depende de los requisitos reglamentarios pertinentes, que debe consultar con las autoridades competentes. La Norma sí indica que las especies de plantas seleccionadas para la prueba deben corresponder a diferentes familias de plantas para considerar la diversidad taxonómica en el reino vegetal y obtener resultados fiables y reproducibles. En la elección de las especies se debe tener en cuenta su diversidad taxonómica en el mundo vegetal, su distribución, la abundancia de características específicas del ciclo de vida de las especies y la existencia natural regional. En general se pueden utilizar especies propias de cultivos, así como otras especies no cultivadas habitualmente. Entre las especies de cultivo pueden considerarse como habituales: tomate, pepino, lechuga, soja, repollo, zanahoria, avena, maíz, cebolla o forraje. Para especies no cultivadas habitualmente, recomendamos solicitar información a las autoridades reguladoras para incluir las que realmente sean idóneas para la zona de uso del producto.
Dependiendo del objetivo del estudio, se puede realizar una prueba con múltiples concentraciones para determinar la curva de dosis-respuesta, o con una sola concentración como prueba límite (con una concentración de 1.000 mg/Kg de tierra seca). Por cada concentración se analizan 4 réplicas, analizando al menos un total de 20 semillas por concentración.
La realización de la prueba con múltiples concentraciones debe realizarse con un mínimo de 5 concentraciones en serie geométrica, con un factor no mayor de 3. Esta prueba permite determinar, mediante un análisis estadístico apropiado, la concentración o proporción que provoca un efecto tóxico (ECx: Effect concentration; ERx: Effect rate) con una alteración o daño indeseable para cada especie (germinación, peso de biomasa, número final de plantas presentes, alteración visible). Las concentraciones de ensayo deben ser adecuadas, por ejemplo, si se desea conocer el EC50, las concentraciones de ensayo deben incluir aquellas que causen un efecto del 20 al 80%. Si el cliente conoce el rango de concentraciones que causa dicho efecto puede solicitar la prueba indicando las concentraciones de ensayo. Si las desconoce, deberá realizar primero la prueba de búsqueda de rango. También, si se solicita, puede calcularse la concentración en la que no se observan efectos (NOEC: No Observed Effect Concentration) y la concentración más baja donde se observan efectos (LOEC: Lowest Observed Effect Concentration). Para determinar estas concentraciones, se requieren un número mayor de réplicas para obtener la potencia estadística deseada.
Si el cliente no conoce las concentraciones a probar en la prueba con múltiples concentraciones, puede realizar una prueba preliminar de búsqueda de rango para determinar las concentraciones que se probarán en el estudio definitivo de dosis-respuesta. Para la prueba de búsqueda de rango, las concentraciones de prueba deben espaciarse ampliamente (por ejemplo, 0,1, 1,0, 10, 100 y 1000 mg/kg de suelo seco). Para productos fitosanitarios, las concentraciones podrían basarse en la concentración o tasa de aplicación recomendada o máxima, por ejemplo, 1/100, 1/10, 1/1 de la concentración de aplicación recomendada/máxima.
Para realizar las pruebas, el cliente debe proporcionar al laboratorio la siguiente información: prueba a evaluar según la vía esperada de exposición (incorporación a tierra; aplicación en superficie); tipo de prueba a realizar (preliminar, de múltiples concentraciones o prueba límite) intervalo de concentraciones que se desee evaluar (expresadas en mg de producto/ kg de tierra seca); naturaleza del producto y su solubilidad (si es insoluble en agua, debe indicarse cuál es el solvente orgánico recomendado); tipo de plantas frente a las que se desea evaluar (de cultivos habituales u otras), a ser posible consultando con las autoridades de registro pertinentes por si requieren alguna especial; tipo de parámetro a determinar (EC50, NOEC…). Se debe tener en cuenta que, si el solvente empleado es diferente al agua, se deberá añadir un control adicional del solvente.