Prueba de reversión de mutaciones bacterianas (Bacterial Reverse Mutation Test) – Normas UNE-EN ISO 10993-3: 2015 (Biological Evaluation of Medical Devices, Part 3: Test for Genotoxicity, Carcinogenicity and Reproductive Toxicity) y OECD 471: 1997 (Bacterial Reverse Mutation Test)

 

Prueba acreditada por ENAC.

Prueba con el certificado de Buenas prácticas de laboratorio (BPLs) . 

 

La norma ISO 10993-3: 2014 indica estrategias y pruebas para identificar los riesgos de genotoxicidad, carcinogenicidad y toxicidad reproductiva aplicables para evaluar el potencial de los dispositivos médicos (productos sanitarios) para provocar genotoxicidad, carcinogenicidad y toxicidad reproductora. Estas pruebas pueden realizarse utilizando células de mamíferos, bacterias, levaduras u hongos filamentosos para determinar si las muestras sometidas a las pruebas pueden inducir mutaciones de genes, alterar la estructura cromosómica o provocar otros cambios en el ADN. 

La norma ISO 10993-1: 2009/2010, indica cuándo deben considerarse estas pruebas en la evaluación biológica de seguridad de un dispositivo médico (producto sanitario). En esta norma se indica que las pruebas de genotoxicidad no son necesarias para los dispositivos médicos (productos sanitarios) y sus componentes, cuando se conozca que no poseen genotoxicidad. Las pruebas están indicadas cuando los materiales incluidos en los dispositivos médicos puedan tener componentes que puedan interaccionar con el material genético, o cuando la composición química del dispositivo médico se desconoce. 

Para realizar las pruebas de genotoxicidad pueden utilizarse varios tipos de pruebas in vitro, bien en serie de dos pruebas o de tres pruebas. Cuando se opte por la realización de tres pruebas éstas incluirán: una prueba para mutaciones génicas utilizando bacterias (OECD 471), una prueba para mutaciones génicas utilizando células de mamíferos (OECD 476), y una prueba de clastogenicidad utilizando células de mamíferos (OECD 473). Cuando se opte por la realización de dos pruebas, se requerirá una prueba para mutaciones génicas utilizando bacterias (OECD 471) y una prueba para mutaciones génicas utilizando células de mamíferos (OECD 476) pero en la que se realice la determinación del número de colonias y su tamaño con vistas a cubrir ambos tipos de objetivos (mutaciones génicas y clastogenicidad). Si los resultados de las pruebas in vitro son negativos no está indicado habitualmente realizar pruebas en animales. 

La función primaria de las pruebas de genotoxicidad es investigar, utilizando células u organismos, el potencial de los productos ensayados para inducir cambios genéticos en humanos que puedan transmitirse a futuras generaciones. Los datos científicos apoyan en general la hipótesis de que los daños en el ADN de las células somáticas son críticos para el inicio del cáncer, por lo que estas pruebas pueden identificar sustancias químicas con potencial carcinogénico. Hasta donde conocemos, no existe un acuerdo internacional de cuál es la mejor combinación de pruebas para un fin concreto. Los métodos más recomendados son los descritos por las normas OECD 471 y OECD 476. 

La prueba descrita en la norma OECD 471 (Bacterial Reverse Mutation Test), reversión de mutaciones en bacterias, utiliza cepas de Salmonella typhimurium y de Escherichia coli que requieren el aporte de aminoácidos esenciales para su crecimiento, porque estas cepas son incapaces de sintetizarlos al ser mutantes deficientes en las vías metabólicas que deben sintetizarlos. Cuando existe un compuesto mutagénico (genotóxico), este compuesto puede inducir la reversión de las mutaciones, restaurando la capacidad funcional metabólica de la bacteria para que sintetice los aminoácidos esenciales. Las bacterias revertidas se detectan por su capacidad para crecer en ausencia de los aminoácidos requeridos previamente por la cepa de ensayo parental. Esta prueba es más rápida y sencilla de realizar que las pruebas realizadas con células de mamíferos descrita en la norma OECD 476. Sin embargo, al utilizarse células procariotas que difieren de células de mamíferos en varias características como la captación de moléculas, metabolismo de moléculas, estructura cromosómica y proceso de reparación del ADN, los resultados obtenidos no son completamente equiparables a los que podría inducir la sustancia mutagénica en mamíferos. 

Por ello, se utiliza como un método de cribado (screening) inicial para detectar la posible actividad genotóxica y en particular para detectar mutaciones puntuales. Existe suficiente información que demuestra que muchas sustancias químicas que evidencian un efecto mutagénico con esta prueba, también exhiben actividad mutagénica en otras pruebas que utilizan células de mamíferos. De la misma forma, hay sustancias químicas que no manifiestan un efecto mutagénico con esta prueba y que sin embargo pueden evidenciarlo con otras pruebas. En ocasiones se ha indicado que esta prueba puede sobreestimar la actividad mutagénica de algunas sustancias. Esta prueba no es útil para evaluar sustancias químicas con actividad bactericida, ni de aquellas sustancias que se sabe que interfieren específicamente con la replicación de células de mamíferos. Tampoco existe una correlación absoluta entre compuestos que demuestran capacidad mutagénica con esta prueba y su capacidad carcinogénica. 

La realización de esta prueba implica utilizar unas suspensiones de bacterias que son expuestas a las sustancias sometidas a evaluación, en presencia o ausencia de un sistema de activación metabólica exógena. Existen fundamentalmente dos métodos de realización: a) método de incorporación de placa, en el que las suspensiones se mezclan con agar de recubrimiento y se siembran inmediatamente en medio mínimo; b) método de preincubación en el que la mezcla de la suspensión bacteriana y la sustancia sometida a ensayo es incubada y a continuación se mezcla con agar de recubrimiento para ser sembrada sobre un medio mínimo. En ambos métodos, después de 2 a 3 días de incubación deben contarse las colonias, para detectar revertidas y comparar con colonias revertidas espontáneamente en placas de control. Las suspensiones de bacterias (5 cepas: cuatro de Salmonella spp. y una de Escherichia coli) deben utilizarse en fase de crecimiento exponencial tardía o estacionaria inicial. La sustancia sometida a ensayo debe utilizarse al menos en cinco concentraciones y deben incluirse los correspondientes controles de solvente/vehículo de la sustancia sometida a ensayo. Así mismo deben ensayarse en paralelo sustancias con y sin capacidad mutagénica. El criterio más admitido de mutagénesis es el aumento de detección de mutantes en función de la concentración dentro del rango probado y/o aumento reproducible a una o más concentraciones en el número de colonias revertidas por placa en al menos una cepa, con o sin activación metabólica.