Irritación cutánea in vitro con método de epidermis humana reconstruida (In vitro Skin irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method –RhE-) (norma OECD 439: 2010)

La irritación cutánea indica un daño irreversible en la piel después de la aplicación de una sustancia química hasta durante 4 horas. La evaluación de la irritación cutánea se ha evaluado con animales de experimentación. Sin embargo, para proteger el bienestar animal su uso debe limitarse, estando prohibido desde hace unos años para evaluar productos cosméticos. Esta norma proporciona un procedimiento in vitro que puede utilizarse para evaluar la capacidad irritante cutánea de sustancias aisladas o de mezclas de ellas, utilizando un modelo experimental de epidermis humana reconstruida (RhE: Reconstructed Human Epidermis). Este modelo simula las propiedades bioquímicas y fisiológicas de las capas  superiores de la piel humana, es decir la epidermis, utilizando como células queratinocitos epidérmicos humanos no transformados, que se adaptan in vitro para formar un tejido equivalente en su citoarquitectura a la piel humana. El modelo RhE utiliza queratinocitos humanos que representan el órgano diana in vitro. Además, implica el paso inicial de la cascada inflamatoria/mecanismo de acción (daño celular y daño tisular resultante del trauma localizado), que ocurre durante la irritación in vivo en animales de experimentación. La prueba puede aplicarse a sustancias sólidas, líquidas, semisólidas y ceras. Los líquidos pueden ser acuosos o no-acuosos; los sólidos pueden ser solubles o insolubles en agua. Cuando sea posible los sólidos deben ser molidos a polvo fino antes de la aplicación y no se requiere ningún otro pretratamiento de la muestra antes de la aplicación. Este método tiene la limitación de que las sustancias químicas muy coloreadas pueden interferir con las medidas de la viabilidad celular, en las que también se utiliza una sustancia cromógena. Para la evaluación puede ser suficiente con tres réplicas cuando los resultados de la prueba permiten una clasificación inequívoca, pero sin embargo, en los casos de situaciones límites, como ocurre cuando no existe concordancia entre las réplicas y/o porcentajes de viabilidad iguales a 50 ± 5%, debe realizarse una segunda repetición, o incluso una tercera, en caso de haberse obtenido resultados discordantes entre las dos primeras series.

 

En la prueba, la sustancia sometida a ensayo se aplica directamente en forma tópica al modelo tridimensional de RhE. Este modelo está constituido por queratinocitos epidérmicos humanos no-transformados, que han sido cultivados para formar un modelo multicapa altamente diferenciado de epidermis humana. El modelo RhE está compuesto de abajo arriba por la capa basal, la capa espinosa (stratum spinosum), la capa granular (stratum granulosum), y el estrato corneo (stratum corneum), que contiene los lípidos intercelulares  análogos a los lípidos encontrados in vivo.

 

La irritación cutánea inducida por sustancias químicas se manifiesta clínicamente por generar eritema y edema, como resultado de una cascada de eventos que comienzan con la penetración del stratum corneum, dañando a continuación las capas subyacentes de queratinocitos. Los queratinocitos moribundos liberan mediadores que inician la cascada inflamatoria, liberando citoquinas que actúan sobre las células de la dermis, particularmente las células del estroma y endoteliales. El aumento de la permeabilidad de las células endoteliales provocan el eritema y edema observados clínicamente. Los métodos in vitro basados en modelos RhE miden las alteraciones inductoras de la cascada inflamatoria que se inicia cuando las sustancias químicas alteran la epidermis. La viabilidad celular de los modelos RhE se mide por la conversión enzimática del colorante vital MTT (bromuro de dimetil-difeniltetrazolio) en azul de formazán que puede medirse cuantitativamente después de extraerse del tejido. Las sustancias irritantes provocan una disminución de la viabilidad celular por debajo de un punto de corte definido (e. gr. ≤ 50% para  productos de categoría 2 UN GHS). Los productos que induzcan viabilidad celular por encima del nivel de corte pueden considerarse no-irritantes (e. gr. > 50%, no categoría de irritantes).