Francisella tularensis (Tularemia) – Cultivo y diagnóstico molecular (PCR)

 

Francisella tularensis es una bacteria intracelular gramnegativa, del género Francisella, familia Francisellaceae. Tiene una distribución mundial, aunque con mayor frecuencia en América del Norte, algunas regiones de Europa y Asia. Este microorganismo se considera principalmente un patógeno animal, aunque puede afectar a las personas, en los que causa la enfermedad denominada tularemia (conocida como fiebre del conejo). Francisella tularensis se ha descrito en aves, reptiles, peces, invertebrados, roedores y otros mamíferos.

Esta bacteria es un bacilo corto pleomórfico, gramnegativo, de 0,2 a 0,7 μm x 0,2 μm y de localización intracelular, fastidioso desde el punto de vista de cultivo por crecer lentamente en forma de colonias pequeñas y requerir medios de agar sangre con glucosa y cisteína. Por estos requerimientos la mayoría de los casos son de diagnóstico clínico.

Desde el año 2000 se admiten dos especies: Francisella tularensis y Francisella philomiragia. La primera especie, F. tularensis, se  clasifica en 4 subespecies: F. tularensis tularensis (tipo A), F. tularensis holarctica (palearctica, tipo B), F. tularensis novicida y F. tularensis mediasiatica. De estas cuatro subespecies, F. tularensis tularensis es la subespecie más virulenta. Las subespecies F. tulsarensis tularensis, F. tularensis holarctica (palarctica) y F. tularensis mediasiatica causan infecciones humanas y de animales. F. tularensis novicida se ha encontrado en pocos casos humanos. Este microorganismo es capaz de sobrevivir fuera de un hospedador durante semanas,  en el agua más de tres meses a temperaturas de 13-15ºC, y de persistir en cadáveres de animales hasta cuatro meses dependiendo de la temperatura ambiental. F. tularensis tularensis (tipo A), se encuentra en Norteamérica y está relacionada con conejos y garrapatas, causando una enfermedad aguda fulminante que antes de la introducción de los antibióticas tenía una letalidad del 10%. F. tularensis holarctica (palearctica) (tipo B) se encuentra en Asia, Europa, y parte de Norteamérica y está relacionada con roedores y liebres y en Europa puede ser transmitida por mosquitos.

El ciclo biológico de este microorganismo implica un hospedador intermediario que actúa como vector de transmisión, generalmente garrapatas y moscas (tábanos), aunque se han encontrado algunos casos atribuidos a mosquitos, que transmiten la infección a través de picaduras durante su alimentación, así como un hospedador definitivo donde se multiplica. Los animales que mantienen la infección en la naturaleza son roedores y lagomorfos (Leporidae –liebres y conejos-, y Ochotonidae –pikas-). Una vez en el hospedador definitivo, Francisella tularensis infecta principalmente los macrófagos, aunque tiene la capacidad de infectar la mayoría de los tipos de células. Su entrada en el macrófago se produce por fagocitosis y la bacteria se encontraría en el interior de la célula infectada en un fagosoma. Posteriormente, sale del fagosoma al citoplasma, donde prolifera rápidamente. Con el tiempo, la célula infectada sufre la apoptosis, y las bacterias son liberadas para iniciar la infección de nuevas células.

Francisella tularensis deben gran parte de su patogenicidad a su capacidad para sobrevivir en el interior de macrófagos no estimulados. Los macrófagos fagocitan con facilidad los microorganismos, pero estos resisten la muerte frente a los radicales oxidantes derivados del oxígeno. Es probable que su resistencia a la muerte intracelular se deba a su superóxido dismutasa. Una vez que los macrófagos se activan, los microorganismos mueren a causa del óxido nitroso intraleucocitario. Una respuesta neutrofílica local contrarresta la infección por este microorganismo en su etapa inicial, pero no logra contener su progreso. La respuesta neutrofílica forma una úlcera cutánea localizada que después se transforma en una lesión cicatrizal cuando los neutrófilos son reemplazados por macrófagos. Posteriormente, los microorganismos se diseminan a distancia, donde forman granulomas. Los microorganismos tienden a acumularse en el tejido linfoide, y los pacientes muestran esplenomegalia y bubones. La tularemia puede confundirse con la peste cuando se observan los bubones.

La transmisión de Francisella tularensis puede ocurrir a través de diferentes vías, con dos principales: por la picadura de un artrópodo (tábanos como Chrysops spp., o garrapatas como Dermacentor spp.) o contacto directo con animales infectado que provocan la forma ulceroglandular, o por inhalación de polvo contaminado, causante de la forma respiratoria neumónica, potencialmente fatal. Otras vías de transmisión incluyen la vía orofaríngea, que ocurre tras la ingestión de carne mal cocinada de un animal enfermo o a la ingestión de agua contaminada con heces u orina de animales infectados, así como la vía conjuntival debido a la inoculación de la bacteria en el ojo, o por contaminación cutánea a través de lesiones de la piel.

La infección se manifiesta aproximadamente a los 3 a 5 días después del contagio. Los signos y síntomas asociados incluyen escalofríos, irritación ocular (en el caso de que la infección se haya producido a través de la conjuntiva), fiebre, cefalea, rigidez articular, dolor muscular, úlceras en la piel, dificultad respiratoria, sudoración y pérdida de peso. Algunas de las complicaciones clínicas asociadas incluyen osteomielitis, pericarditis, meningitis y neumonía.

 

Pruebas recomendadas para el diagnóstico:

 

El diagnóstico de tularemia puede establecerse por cultivo de la bacteria causal, por detección de anticuerpos (ELISA), o por métodos de diagnóstico molecular (PCR).

El aislamiento en cultivo es dificultoso por crecer lentamente en forma de colonias pequeñas y requerir medios de agar sangre con glucosa y cisteína. Por estos requerimientos la mayoría de los casos son de diagnóstico clínico. También se ha podido cultivar en medios de agar chocolate, medio de Thayer-Martín, agar extracto de levadura-cisteína, o en medios líquidos de frascos de hemocultivos. Dos de sus subespecies, Francisella tularensis novicida y Francisella philomiragia pueden desarrollarse en medios habituales no enriquecidos. En cualquier caso, los cultivos tienden a evitarse por el riesgo de infección en el laboratorio (se considera un patógeno de clase 3, y debe manipularse en estas condiciones), además de por las dificultades de cultivo al ser una bacteria de crecimiento fastidioso y lento.

La detección de anticuerpos suele ser el método más utilizado por ser más accesible a muchos laboratorios cuando se utilizan antígenos comercializados. Sin embargo, tropieza con el inconveniente de que los anticuerpos no son detectables antes de las 2 semanas o más, desde la infección. Las pruebas más utilizadas son las de aglutinación directa utilizando suspensiones de bacterias, y las de enzimoinmunoanálisis (ELISA). Debido al tiempo requerido para desarrollarse los anticuerpos y al hecho de que algunas veces las pruebas de anticuerpos son negativas, la detección de anticuerpos no se considera el método más idóneo. Con los métodos de anticuerpos debe tenerse en cuenta que pueden dar reacciones cruzadas con Brucella, Yersinia y Proteus.

Los métodos de diagnóstico molecular (PCR), obvian los problemas indicados para los cultivos y la detección de anticuerpos, por lo que deben considerarse hoy día la primera alternativa para el diagnóstico.

Pruebas realizadas en IVAMI:

 

  • Detección por aislamiento mediante cultivo en medios selectivos.
  • Diagnostico molecular (PCR), para detectar ADN de Francisella tularensis.

Muestra recomendada:

 

  • Sangre total extraída con EDTA (2 a 5 mL).
  • Exudado procedente de lesión cutánea.
  • Exudado obtenido por punción de ganglio linfático afectado.

 

Conservación y envío de la muestra:

 

  • Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
  • Congelada: más de 2 días (sólo para pruebas de diagnóstico molecular).

 

Plazo de entrega:

 

  • Cultivo: 3 a 4 días.
  • Diagnóstico molecular (PCR): 24 a 48 horas.

Coste de la prueba:  

 

           Consultar a ivami@ivami.com