Acanthamoeba spp. - Queratitis amebiana (AK: Amebic Keratitis) y Encefalitis amebiana granulomatosa (GAE: Granulomatous Amebic Encephalitis): Examen microscópico; Aislamiento en cultivo; Diagnóstico molecular (PCR); Identificación de especie (secuenciación).

Información 12-09-2016.

Acanthamoeba spp. es un protozoo de vida libre muy ubicuitario en la naturaleza que se puede encontrar en habitats tan diversos como aguas dulces naturales, aguas de grifos, aguas de piscinas, tierra (suelos), sedimentos de océanos, unidades de aire acondicionado, líquidos de mantenimiento de lentes de contacto, aguas de unidades de diálisis,…, por lo que se consideran los protozoos ambientales más prevalentes. Posee dos fases vitales: trofozoítos con división binaria activa que desarrollan seudópodos hialinos espinosos, y quiste de resistencia que desarrollan cuando cambian las condiciones de temperatura, pH y de sequedad. Se han descrito 15 genotipos distintos (T1 a T15), hecho importante al considerar la sensibilidad de las pruebas moleculares de diagnóstico. El genotipo más prevalente en las infecciones humanas es T4.

Varias especies de Acanthamoeba spp. se han encontrado causando casos graves de infección cerebral, denominados encefalitis amebiana granulomatosa (GAE: Granulomatous Amebic Encephalitis), un proceso que ocurre en individuos inmunocomprometidos, con procesos subyacentes de diagnóstico difícil, que conlleva una evolución crónica, que suele ser fatal y que suele diagnosticarse post-mortem en la necropsia del paciente fallecido, pero que actualmente se han descrito casos en los que se ha podido efectuar el diagnóstico con métodos moleculares aplicados a muestras de líquido cefalorraquídeo antes del fallecimiento, con lo cual puede iniciarse el tratamiento. Además, es responsable de casos de queratitis amebiana (AK: Amebic keratitis) que puede provocar ceguera, afecta a individuos sanos jóvenes, particularmente a los usuarios de lentes de contacto.

La incidencia de la queratitis amebiana se ha incrementado en los últimos 30 años, calculándose una incidencia de 2 a 20 casos por millón de usuarios de lentes de contacto, que en EE.UU. se calcula que corresponden al 10% de la población. Se han descrito brotes ligados al uso de lotes de soluciones líquidas para mantenimiento de lentes de contacto que estaban contaminados con Acanthamoeba spp. Existen casos aislados de individuos que han sufrido un traumatismo corneal, que lavan las lentes de contacto con agua del grifo u otras preparaciones caseras, o que nadan o se duchan con las lentes de contacto puestas. La queratitis amebiana es una infección aguda y dolorosa, con síntomas iniciales inespecíficos como un dolor ocular desproporcionado, fotofobia, enrojecimiento ocular, lagrimeo, en general de afectación ocular unilateral, pero existen casos escritos de afectación bilateral. Los pacientes padecen una erosión del epitelio corneal con irregularidades y edema, acompañado de un infiltrado perineural radial, similar al observado en las infecciones por Pseudomonas aeruginosa. En las fases posteriores aparece una denudación epitelial y necrosis del estroma Además son frecuentes las infecciones bacterianas secundarias, lo cual complica el diagnóstico. Clínicamente se puede confundir con una infección por virus Herpes simple o por hongos (queratitis fúngica).

Estos procesos parece que ocurren en varias etapas: adhesión de las amebas a las células del hospedador, degradación celular e invasión tisular. En  los casos de encefalitis amebiana crónica (GAE) las amebas accederían al sistema nervioso por diseminación hematógena a partir de un lugar primario en el pulmón o en la piel. En las queratitis amebianas, las amebas ambientales se fijarían al tejido ocular dañado de la superficie corneal e invadirían el estroma corneal. Las amebas segregarían proteinasas como las proteasas tipo serina y tendrían ligandos de fijación como las proteínas de adhesión (“Laminin binding protein” y “Mannose binding proteín). Se ha demostrado in vitro que la exposición de las amebas a manosa induce en los trofozoitos la liberación de factores citopáticos y lisis de las células epiteliales corneales. Esta actividad citopática puede inhibirse con moléculas inhibidoras de serin-proteasas, y también inhibiendo la fijación con manosa exógena.

Métodos de diagnóstico posibles:

• Examen microscópico: el examen microscópico puede realizarse en fresco o en extensiones teñidas. Para su realización se requiere preparar frotis en portaobjetos de vidrio a partir de las lesiones. Para el examen en fresco se puede utilizar una solución de KOH. Para el examen de extensiones se pueden utilizar tinciones (Giemsa, hematoxilina-eosina, PAS, inmunoperoxidasa, o tinción fluorescente con blanco calcofluor). De estas tinciones las más utilizadas son la de Giemsa que permite observar trofozoítos o quistes, o la tinción con blanco de calcofluor por facilitar la visualización de los quistes. Los quistes de morfología poliédrica o estrellada son más fáciles de observar que los trofozoítos que pueden confundirse con células inflamatorias degeneradas. Esta tinción puede realizarse sobre extensiones que hayan sido previamente teñidas con Giemsa o hematoxilina-eosina.

• Cultivos: puede aislarse en cultivo en medios de agar no nutritivo recubiertos de una bacteria no capsulada como Escherichia coli o Enterobacter aerogenes, pero requiere una incubación de días o semanas antes de descartar su presencia, observando los cultivos  periódicamente con un microscopio invertido. Así mismo, pueden inocularse las muestras en cultivos celulares, en los que provoca la destrucción de las células. El problema de los cultivos es que las muestras obtenidas por raspado de las lesiones deben procesarse de inmediato, por lo que no es idóneo para este tipo de muestras cuando deben enviarse a un laboratorio distante. Los cultivos si son útiles cuando se trata de realizar su detección en las soluciones de mantenimiento de lentes de contacto, que pueden remitirse a un laboratorio distante.

• Diagnóstico molecular: actualmente es el método más recomendado por su rapidez y especificidad, y no estar sujeto a las limitaciones de sensibilidad y conservación de los otros procedimintos. Puede realizarse con raspados corneales, pero se ha demostrado que también puede realizarse en lágrimas, con lo cual no se requiere utilizar un método invasivo. También puede realizarse con torundas de dacrón impregnadas en las lesiones, con las soluciones de mantenimiento de lentes de contacto, o con líquido cefalorraquídeo en casos de encefalitis amebiana granulomatosa. Debe tenerse en cuenta que algunos fármacos utilizados en el tratamiento o utilizados como anestésicos locales pueden inhibir la prueba de PCR, por lo que deben tomarse las muestras antes de su uso.

Pruebas realizadas en IVAMI:

• Diagnóstico molecular por PCR.

• Examen microscópico, mediante tinción de Giemsa o de blanco de calcofluor.

• Cultivo en medios de agar con bacterias (cultivos no axénicos) o de líneas celulares.

Muestras recomendadas:

• Diagnóstico molecular.

• • Torunda de dacrón impregnada en lesión corneal. En los casos de queratitis la muestra idónea es el raspado corneal realizado por un especialista (oftalmólogo). Esta muestra tiene la dificultad de su transporte y está más indicado para preparar frotis o cultivos sembrados directamente junto al paciente. En este caso, recomendamos la impregnación de torunda de diámetro pequeño de nylon o dacrón. No deben utilizarse torundas con vástagos de madera, ya que éstos pueden tener sustancias inhibidoras de las pruebas moleculares.

• • Lágrimas impregnadas en toruna de dacrón (no de alginato ni agodón), en los casos de queratitis cuando no se pueda o no se deba realizar un raspado corneal.

• • Líquido obtenido por punción ocular en caso de afectación intraocular. Cuando exista una endoftalmitis y se realice una punción, aspirar con jeringa de aguja muy fina (tipo tuberculina). Si la muestra es imperceptible recomendamos enviar la jeringa dentro de un tubo estéril para que en el laboratorio lavemos el conducto de la aguja o bien que el propio Centro de obtención de la muestra depositen unas gotas (3-4) de solución fisiológica estéril en un vial de plástico estéril (tubo tipo Eppendorf), y aspiren y expulsen el líquido para lavar el trayecto del conducto de la aguja. Si existe un volumen mayor que pueda depositarse dentro de un vial, depositar el volumen extraído

• • Liquido de mantenimiento de lentes de contacto. En el caso de sospecha de infección a través de lentes de contacto, se recomienda enviar tanto las lentillas como el líquido donde se encuentren.

• • Líquido cefalorraquídeo en caso de sospecha de encefalitis amebiana granulomatosa.

• Examen microscópico:

• • Extensión (frotis) en un portaobjetos de vidrio preparado en la consulta por el oftalmólogo, a partir del exudado obtenido de la lesión.

• Cultivo:

• • Muestras de líquido obtenido por punción ocular o con torunda que debe recibirse en el laboratorio dentro de un periodo de tiempo corto, por lo que no es recomendable.

Conservación y envío de la muestra:

• Refrigeración, cuando el tiempo de llegada al laboratorio sea inferior a 24 horas.

• Envío refrigerado dentro de recipiente de seguridad biológica, y dentro de contenedor isotérmico con acumulador de frío (pack –frigolín- congelable).