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Clostridium difficile – Cultivo; detección de citotoxina en cultivo celular; detección de genes de toxinas A, B y toxina binaria por PCR; detección de deleciones en gen tcdC (cepas hipervirulentas); identificación de ribotipo (cepas hipervirulentas NAP1/BI/027 y otras).

 

Información (10-04-14)

 

Clostridium difficile, una bacteria anaeróbica estricta productora de esporas, fue reconocido como un patógeno potencial entérico a finales de 1970,  cuando se relacionó con los casos de colitis seudomembranosa que aparecían al administrar antimicrobianos de amplio espectro.

Con posterioridad se ha visto que su patogenicidad está relacionada con el 20 a 30% de los pacientes que presentan cuadros diarreicos asociados con antibióticos; con el 50 a 75% de los casos de colitis asociadas a antibióticos, y con más del 90% de los casos de pacientes afectos de colitis seudomembranosa. Ello es debido a que Clostridium difficile puede producir uno o dos tipos de toxina (toxina A –una enterotoxina-, y toxina B –una citotoxina-). Estas toxinas provocan diarrea (la enterotoxina), o una inflamación intensa del colon (la citotoxina). La mayoría de los afectados son personas de edad avanzada, hospitalizadas o ingresadas en residencias para enfermos crónicos, que tras ser tratados con antibióticos desarrollaban la diarrea o la colitis asociada con antibióticos. Sin embargo, actualmente se están produciendo casos de diarreas y colitis asociadas con Clostridium difficile, en personas que no se consideraban de riesgo, como individuos jóvenes, o que no han sido tratados con antibióticos, ni han estado ingresados en hospitales.

La mayoría de las cepas patogénicas producen toxina A (una enterotoxina), y toxina B (una citotoxina) (cepas toxina A-positivo; toxina B-positivo = A+B+). Se han encontrado también cepas productoras únicamente de toxina B (cepas toxina A-negativas; toxina B-positivas = A-B+). Las toxinas A y B son glucosiltransferasas similares a otras citotoxinas de clostridios.

Las dos toxinas referidas, A y B, están codificadas por dos genes distintos: tcdA y tcdB, que junto con los genes tcdC, tcdD y tcdE forman un locus de patogenicidad de 19,6 kb (locus PaLoc con el siguiente orden de genes: gen tcdD, gen tcdB, gen tcdE, gen tcdA, gen tcdC). Estas toxinas son las responsables del daño intestinal que ocurre durante la infección. Las cepas de C. difficile que no producen toxinas no son patógenas. Por ello, para realizar un diagnóstico correcto debe investigarse la presencia de una, o de ambas toxinas, en las muestras de heces. El aislamiento de las cepas toxigénicas (cultivos toxigénicos) contribuye al diagnóstico de diarrea asociada a C. difficile.

El tipado toxigénico permite diferenciar las variantes A-B+, en las que el extremo 3´ del gen de la toxina A tiene una deleción y diferenciarlas de las cepas A+B+. Se pensaba que las variantes A–B+ no eran patógenas y se aislaban de niños asintomáticos. Sin embargo, varios autores han señalado casos de colitis seudomembranosa, o de diarreas asociadas con los antibióticos, provocadas por cepas A-B+.

Las cepas A-B+ fueron detectadas en 1991-1992 (CCUG8864). Estas cepas tenían una gran deleción en el gen de la toxina A y a pesar de ello causaba enfermedad en el modelo animal. La toxina B de estas cepas es débilmente enterotóxica en el modelo experimental del asa intestinal de conejo y 10 veces más letal que otras toxinas B. En 1993, se observó que el serotipo F de otras variantes A-B+ que no era virulenta en modelo animal, se aisla habitualmente de niños asintomáticos. Una vez que se dispone del cultivo se puede detectar un fragmento interno del gen de la triosafosfato isomerasa (tpi: triose phosphate isomerase) que es un gen housekeeping, un fragmento interno del gen de la toxina B (tcdB), y de la región 3´, delecionado o no, del gen de la toxina A (tcdA). Se han caracterizado 10 toxinotipos (I a X), según las deleciones o adiciones dentro de varias regiones de los genes de toxinas u otras regiones del elemento toxigénico PaLoc (pathogenicity locus).

En el año 2002, apareció una cepa epidémica de Clostridium difficile (cepa NAPI / BI / 027) que se caracteriza por implicar mayor gravedad al proceso. Esta cepa posee una deleción de un nucleótido (por ej. nucleótido 117; tcdCΔ117), o a veces hasta 18 pb (Δ330-347), en el gen regulador tcdC que se traduce en una hiperproducción de las toxinas A y B ya que aquel gen participa en la regulación de la expresión de la toxina, pero también algunas de estas cepas son productoras de la toxina binaria. Además, estas cepas son más resistentes a los antimicrobianos. La cepa produjo brotes epidémicos en EE.UU. y algunos países de Europa. La toxina binaria encontrada en estas cepas es diferente en actividad a las toxina A o B (glucosiltransferasas), ya que posee una actividad de ADP-ribosiltransferasas específicas de actina (Actin-specific ADP-ribosyltransferase), similar a la toxina “t” de Clostridium perfringens.

La cepa  NAP1/BI/027, es una de las cepas hipervirulentas con resistencia a fluoroquinolonas y otros antimicrobianos como macrólidos. Esta cepa recibió este nombre por NAP1: North American Pulse Field Gel Electrophoresis tipo 1-PFGE (tipo 1 por Electoforesis de Campos Pulsados en Norteamérica); BI por el tipo diferenciado con enzimas de restricción -Restriction Endonuclease analysis-; 027 por el tipo obtenido mediante ribotipado -PCR Ribotyping-. Esta cepa se suele denominar en ocasiones únicamente como "ribotipo 027" o sólo "cepa 027", ya que el tipado por PFGE no se suele realizar, ni tampoco el tipado con endonucleasas de restricción. Hoy día hay otros ribotipos que también corresponden a cepas hipervirulentas y resistentes que se están extendiendo, incluso sobrepasando al ribotipo 027, como son 037, 018 y 078.

Epidemiología

Esta bacteria se encuentra en el medio ambiente (suelo, agua, heces humanas y de animales, alimentos de varios tipos, …), y muchas personas son portadores intestinales de ella. En los centros sanitarios existen mayor número de portadores a nivel intestinal. Las esporas de esta bacteria se excretan con las heces de personas y animales, y pueden permanecer en el medio ambiente durante semanas o meses, contaminando alimentos y objetos cuando no existe una buena higiene de manos. La prevalencia de la colonización intestinal puede ser del 50% en pacientes hospitalizados, 5 a 7% en residentes de centros de estancias prolongadas, y en el 2% de adultos ambulatorios. Entre los portadores hospitalizados, la tasa de colonización es superior en aquellos pacientes que han recibido antibióticos. 

Factores de riesgo

Se consideran factores de riesgo:

Patogénesis

En el intestino existen muchísimas bacterias (107 aerobios/g y 109 anaerobios/g de heces). Estas bacterias nos defienden de infecciones, y al mismo tiempo nos aportan cofactores metabólicos que absorbemos. La infección por Clostridium difficile se establecería en tres etapas: 1) alteración de flora normal intestinal como consecuencia de la administración de antibióticos. Clindamicina fue el primer antibiótico relacionado con la colitis seudomembranosa; después casi todos los antimicrobianos se han relacionado, cefalosporinas, penicilinas, y fluoroquinolonas. Al administrar a una persona  antimicrobianos para tratar una infección, éstos destruyen una parte de las bacterias intestinales y dejan un habitat libre para que Clostridium difficile prolifere; 2) adquisición de una cepa toxigénica de Clostridium difficile. La bacteria puede encontrarse en el medio hospitalario, donde al mismo tiempo existen mayores probabilidades de contaminación. En muchos casos, la transmisión tiene lugar por el personal sanitario a través de manos contaminadas; 3) Una vez establecida en el intestino, produce la/s toxina/s. El periodo de incubación exacto se desconoce,  pero no suele ser superior a 7 días. La/s toxina/s elaborada/s producen la diarrea acuosa, y destruyen las células de la mucosa en el colon desencadenando la colitis. 

Sintomatología

Algunas personas son portadoras de Clostridium difficile en el intestino pero nunca enferman, aunque si pueden transmitir la infección. La enfermedad por Clostridium difficile suele desarrollarse durante el tratamiento con antimicrobianos, o hasta después de unos meses de haber sido tratada con antibióticos.

La mayoría de los pacientes presentan una infección leve o moderada, lo más frecuente una diarrea acuosa, con deposiciones líquidas tres o más veces al día, durante 2 ó más días. En otras ocasiones padecen una infección grave, acompañada de deshidratación que requiere hospitalización, debido a una inflamación del colon con áreas ulceradas que sangran y supuran (colitis seudomembranosa). En estos casos, los pacientes tienen diarrea acuosa, con 10 ó 15 deposiciones al día, dolor abdominal, fiebre, sangre y pus en las heces, nauseas, deshidratación, anorexia, pérdida de peso, distensión abdominal, leucocitosis, y fracaso renal.

 

Complicaciones:

Deshidratación, fracaso renal, megacolon tóxico (distensión por gases producidos por la bacteria), perforación intestinal (por daño extenso de mucosa), muerte.

Tratamiento:

Se recomienda detener la administración del antimicrobiano que se esté administrando, y en caso de requerirse su administración, cambiar a otro.

Los antimicrobianos más recomendados son:

Otras medidas adyuvantes son:

Diagnóstico de laboratorio

Existen varios procedimientos para detectar la presencia de toxina en las heces y para caracterizar las cepas, que exponemos a continuación:

Pruebas realizadas en IVAMI:

Muestra recomendada:

Conservación y envío de la muestra:

Plazo de entrega:

Coste de la prueba: