Rhizobium spp.: Aislamiento en cultivo cuantitativo; Identificación molecular de especies (PCR y secuenciación)

Información 10-06-2019.

Los rizobios incluyen a bacterias de enorme valor en agricultura porque ser los que proporcionan la mayor fuente de nitrógeno en los suelos (tierras). Además de la fijación de nitrógeno, muchas cepas de rizobios actúan como potenciadores del crecimiento de plantas (PGPR: Plant-growth-promoting rhizobacteria) ya que producen fitohormonas, factores reguladores del crecimiento, sideróforos, enzimas hidrolizantes, desaminasa de 1-aminociclopropano-1-ácido carboxílico (ACC), y solubilizan el fosfato inorgánico y potasio. Esto hace que los rizobios sean muy valiosos tanto para las plantas leguminosas, como para las no-leguminosas. La aplicación de los rizobios como biofertilizantes asegura la eficacia en la productividad de los cultivos y reduce la necesidad de utilizar fertilizantes artificiales. Por otra parte, estos microorganismos beneficiosos también actúan como agentes de biocontrol de plagas y enfermedades mediante la inducción de resistencia

Los estudios más amplios de interacción de microorganismos fijadores de nitrógeno de plantas han sido las simbiosis de rizobios y leguminosas, en las que la bacteria fija el nitrógeno atmosférico como endosimbiontes en el interior de los nódulos de las raíces en un microambiente rico en nutrientes y de oxígeno controlado. Esta simbiosis es una interacción específica de hospedador, donde el rhizobia solo formará nódulos en una especie hospedadora y con muy pocas inoculaciones cruzadas.

Recientemente, los investigadores han propuesto la posibilidad de inocular rizobios en plantas no-leguminosas como el arroz y se han publicado informaciones aisladas con la facilitación del crecimiento de plántulas y producción de granos. Sin embargo, el mecanismo no está claro y no se debe a la formación de nódulos como en la simbiosis de los rhizobia y las leguminosas. Se ha postulado que el efecto puede ser mediante los beneficios de la producción de fitohormonas, la solubilización de fosfatos, la mejora en la asimilación de nitrógeno del suelo, o cambiando la morfología de las raíces.

Entre los rizobios se encuentran varios géneros: Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium, Methylobacterium y Allorhizobium. De ellos, las especies de Rhizobium forman una asociación endosimbiótica con las raíces de leguminosas y Parasponia.

Existen varias especies diferentes de Rhizobium que están categorizados en base a de la tasa de crecimiento y el tipo de planta a las que están asociadas. Algunas especies de Rhizobium son: R. leguminosarum, R. alamii, R. lentis, R. japonicum, R. metallidurans, R. smilacinae, R. phaseoli, R. trifolii.

La bacteria coloniza las células de las plantas dentro de nódulos de las raíces, donde convierten el nitrógeno atmosférico en amonio usando la enzima nitrogenasa, que convierte el nitrógeno atmosférico en amonio usando la enzima nitrogenasa. De esta forma proporcionan compuestos nitrogenados como glutamina o ureidos para la planta. La planta, al mismo tiempo, proporciona a la bacteria compuestos orgánicos elaborados mediante la fotosíntesis. Esta relación de beneficio mutuo es verdadera para todos los Rhizobia de los cuales el género Rhizobium es un ejemplo típico.

Existen medios de cultivo, como el medio YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar), con Rojo Congo que permite diferenciar las colonias de Rhizobium ya que éste no absorbe el colorante lo que permite diferenciarlos por el color de las respectivas colonias. Además, posteriormente se pueden agregar diferentes inhibidores para inhibir el crecimiento de posibles contaminates. Entre ellos, la adición simultánea de pentacloronitrobenceno (PCNB) y vancomicina en el medio PV-YEMA que permite una mejora significativa en la eficiencia de la enumeración de rizobios impidiendo eficazmente el crecimiento de hongos y bacterias grampositivas.

La identificación de los rizobios se suele realizar mediante pruebas bioquímicas y morfológicas de las colonias aisladas en cultivo. Sin embargo, en los últimos años, se han aplicado los métodos de identificación mediante PCR empleando la amplificación y secuenciación del gen RNA16S, permitiendo una identificación más rápida y precisa de los aislados.

Biofertilizantes

Los biofertilizantes son productos a base de microorganismos benéficos del suelo, en especial bacterias y/o hongos, que viven asociados o en simbiosis con las plantas y ayudan de manera natural a su nutrición y crecimiento, constituyendo una fuente alternativa a los fertilizantes químicos.

En la actualidad el uso indiscriminado de productos químicos en la agricultura constituye un problema global. Aunque estos promovieron un incremento considerable de los rendimientos agrícolas durante varios años, ahora son la principal causa de la pérdida de la fertilidad de los suelos, de la contaminación de las aguas subterráneas y, en muchos casos, de daños a la salud humana. Esta situación se agudiza con la creciente demanda de alimentos y el agotamiento progresivo de los recursos no renovables de la Tierra. Por ello, se hace evidente la necesidad de buscar alternativas que permitan la sostenibilidad agrícola. Es conocida la capacidad de las leguminosas para utilizar el N₂ del aire, a través de la eficiente relación simbiótica que se establece entre estas plantas y las bacterias fijadoras de nitrógeno (diazotrofas). El proceso de colonización de estas bacterias, si bien ocurre de forma natural, en ocasiones no resulta del todo eficiente, lo cual se debe, entre otras causas, a que la carga microbiana en los suelos es muy baja, como producto de la erosión. En los últimos años se ha incrementado el uso de rizobios como biofertilizantes, ya que los beneficios para las plantas y el suelo son apreciables. La inoculación de plantas con bacterias beneficiosas se remonta a siglos atrás. A finales del siglo XIX, la práctica de mezclar suelo "inoculado naturalmente" con semillas se convirtió en un método recomendado de inoculación de leguminosas en los EE.UU. Una década más tarde, se registró la primera patente de inoculación de plantas con Rhizobium spp.

Para obtener un buen rendimiento en el cultivo de leguminosas es necesaria la utilización de fertilizantes nitrogenados, que elevan los costos de producción afectando la economía de los productores y consumidores. Una alternativa a este problema es la utilización de inóculos bacterianos conteniendo rizobios viables y seleccionados por su infectividad y efectividad simbióticas.    

Pruebas realizadas en IVAMI 

• Aislamiento en cultivo con cuantificación en medios diferenciales.

• Identificación molecular de especies (PCR y secuenciación). 

Muestras recomendadas

• Raíces de plantas con nódulos.

• Fertilizantes (abonos): 25 mL/25 g.

Conservación y envío de la muestra:

• Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.

Plazo de entrega de resultados:

• 5 a 10 días laborables.

Coste de la prueba:  

• Cuantificación mediante aislamiento en cultivos: consultar a ivami@ivami.com

• Identificación molecular de especie (PCR y secuenciación): consultar a ivami@ivami.com