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Prueba Challenge para alimentos (ISO 20976-1: 2019. Prueba de eficacia de conservantes para alimentos y piensos- Parte 1: Potencial de crecimiento, tiempo de latencia y tasa máxima de crecimiento).

Las pruebas de eficacia de conservación (Challenge) para alimentos tienen como objetivos estudiar la capacidad de crecimiento, el tiempo de latencia y la tasa máxima de crecimiento de los microorganismos inoculados, con el objetivo de conocer su estabilidad microbiológica. Los ensayos tienen como objetivo la evaluación del potencial de crecimiento o la cinética de crecimiento (tiempo de latencia y tasa máxima de crecimiento). Los estudios del potencial de crecimiento sirven para validar la vida útil de un alimento a nivel microbiológico y evaluar si el alimento, bajo unas condiciones específicas permite el crecimiento del microorganismo inoculado; mientras que los estudios de cinética de crecimiento evalúan si las características intrínsecas (pH, aw…etc.) o extrínsecas (temperatura, composición de gases… etc.) son capaces de ejercer un impacto en el comportamiento del microorganismo inoculado. En el estudio de la cinética del crecimiento se determina el tiempo de latencia y la tasa máxima de crecimiento, esta última puede emplearse para la determinación de la vida útil del alimento. 

El comportamiento de una población microbiana en un alimento, depende de varias características propias del alimento como son su actividad de agua (aw: water activity), su pH, su concentración de conservantes, etc.; del estado fisiológico de las bacterias; de las condiciones de conservación del alimento (temperatura, formato de envasado y composición de la atmósfera gaseosa en la que se encuentre); del proceso de preparación del alimento; así como de las interacciones con los microorganismos naturales presentes en el alimento. 

Las pruebas se realizan en el laboratorio inoculando uno o varios lotes de un alimento con bacterias en forma vegetativa y con esporas. Las cepas empleadas en el ensayo deben ser las que el fabricante considere adecuadas por las características del alimento, por ejemplo, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. o especies como Bacillus spp. (esporas). Se recomienda que se utilicen cepas que se hayan aislado a partir de alimentos y, para estimar el potencial de crecimiento, si es posible, una mezcla de varias cepas de la misma especie, para tener en cuenta la variabilidad entre cepas. Para estimar la tasa de crecimiento, solamente se debe utilizar una cepa por ensayo. 

Es importante determinar el número de lotes y los criterios para su selección. Para determinar el número de lotes debe considerarse la variabilidad del proceso de producción. Si la variabilidad de las características del alimento entre los distintos lotes (por ejemplo, las propiedades fisicoquímicas o microbiológicas) es suficientemente amplia para provocar diferencias en el comportamiento del crecimiento microbiológico, es necesario estudiar diferentes lotes, como mínimo 3 lotes. Si la prueba de eficacia de conservación (Challenge) se realiza en un único lote, permite únicamente una estimación del comportamiento bacteriano para el mismo conjunto de características del alimento. Por ello, como norma general se recomienda como mínimo estudiar tres lotes, seleccionando lotes representativos de la variabilidad intrínseca de la matriz del alimento estudiado. Si se utiliza un único lote debe justificarse: por evaluar el impacto de una nueva formulación, utilizar un lote que presente condiciones más favorables para el desarrollo de microorganismos, es decir el peor escenario (por ejemplo, con el pH y actividad de agua más elevados, menor concentración de conservantes, etc.), o haber demostrado previamente que la variabilidad entre lotes no es significativa y debe ser informado por parte del solicitante de la prueba. De acuerdo con la norma, en el laboratorio se inoculan tres unidades por tiempo de muestreo, si se recibe sólo un lote, o una unidad de tres lotes distintos por cada tiempo de muestreo. De cada una de las unidades y lotes inoculados deben realizarse muestreos en distintos momentos del ensayo, que permitan obtener un mínimo de 5 puntos para la estimación del potencial de crecimiento y de 8 para la prueba de cinética del crecimiento en los que deben realizarse los recuentos de bacterias para poder elaborar la curva de desarrollo bacteriano y los cálculos correspondientes.

Además, deben emplearse en el ensayo alimentos control, no inoculados con el microorganismo de ensayo, que permiten determinar el nivel de contaminación natural del alimento. Para ello se analizan el mismo número de unidades que para el ensayo con las muestras inoculadas (una unidad de 3 lotes diferentes) que únicamente se analizan a dos tiempos, inicial y final. 

La norma ISO 20976-1 no establece un criterio para determinar si el alimento permite el crecimiento del microorganismo de ensayo, sino que este criterio se debe establecer previamente a los ensayos de acuerdo con el objetivo del ensayo, por ejemplo: el alimento permite el crecimiento si se observa un potencial de crecimiento superior a 0,5 log UFC/g.