Bacterias lácticas en muestras clínicas, derivados lácteos y preparados probióticos: cultivo cualitativo y cuantitativo, identificación molecular (PCR y secuenciación).

Información 11-04-2021.

Los probióticos son microorganismos vivos que cuando son administrados en la cantidad adecuada, promueven beneficios en la salud de la persona que los ingiere siempre que cumplan con la definición y requisitos establecidos por la Organización mundial de la Salud (OMS) y la Organización de las Naciones Unidas (FAO).

Las bacterias ácido lácticas (BAL) o bacterias del ácido láctico se reúnen en la familia Lactobacillaceae que comprende unos 20 géneros diferentes de entre los que destacan los siguientes: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus, Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella. De ellos, Lactobacillus es el más amplio de todos.

En 1919 se inició la clasificación de BAL como un grupo de organismos fisiológicamente uniformes y morfológicamente heterogéneo incluyendo a cocos y bacilos de longitud variable (0,5-0,8 µm) y de pared celular con estructura de grampositivos. Son microorganismos no esporulados (excepto Sporolactobacillus inulinus), inmóviles, anaerobios, microaerofílicos o aerotolerantes; no productores de oxidasa, ni de catalasa, carecen de citocromos, no reducen el nitrato a nitrito y producen ácido láctico como el único o principal producto de la fermentación de carbohidratos. Además, las BAL son ácido-tolerantes pudiendo desarrollarse en un rango de pH entre 3,2 y 9,6, aunque la mayoría de desarrollan mejor a pH entre 4,0 y 4,5.

Las BAL también se clasifican, según los metabolitos finales de la fermentación de carbohidratos, en homofermentativas (sólo producen ácido láctico como metabolito final) y heterofermentativas (produce ácido láctico y otros metabolitos finales), y según la temperatura de crecimiento en mesófilos y termófilos.

Estas bacterias son muy utilizadas porque producen metabolitos que cumplen funciones específicas, entre los que destaca la producción de ácido propiónico, cítrico y láctico; además producen sustancias antimicrobianas, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas, exopolisacáridos (EPS); compuestos que contribuyen al sabor, olor, textura y valor nutricional de los alimentos y productos fermentados; elaboración de bebidas lácticas, ensilados (conservación del forraje mediante acidificación), vitaminas y probióticos.

El consumo de las BAL como probióticos se ha asociado con una serie de efectos beneficiosos para los sistemas digestivo, inmunitario, endocrino, cardiovascular y nervioso entre los que destacan:

• Mantenimiento de la biota intestinal, movimiento intestinal, mejora en la permeabilidad intestinal, reducción de diarreas y tratamiento de problemas digestivos y reducción de síntomas debidos a una mala absorción de lactosa. 

• Modulación e estimulación del sistema inmunológico. 

• Posibles mecanismos de acción con potencial para la prevención y el tratamiento del cáncer de colon y de otros órganos. 

• Efectos sobre el sistema cardiovascular: como posible antitrombrombótico por liberación de péptidos con capacidad de inhibir la formación del trombo (coágulo) en los vasos sanguíneos, antihipertensivo disminuyendo moderadamente la presión sanguínea y como hipocolesterolémico disminuyendo el colesterol sérico previniendo enfermedades cardiovasculares. 

• Beneficios atribuidos a probióticos en general. 

Para conseguir el efecto beneficioso en la salud del hospedador, un cultivo probiótico debe ser ingerido en la cantidad adecuada. La cantidad de BAL recomendada se encuentra en el rango de 10⁶-10⁷ UFC/g de producto. Las BAL empleadas generalmente como probiótico se encuentran disponibles comercialmente en estas cantidades en los productos fermentados, preparados alimenticios y suplementos. Los géneros de BAL más utilizados como probióticos son: Bifidobacterium animalis subsp. animalis y B. animalis subsp. lactis, B. brevis, B. bifidum, B. infantis, B. longum; Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. reuteri, L. plantarum, L. casei GG; Streptococcus salivaris subsp. thermophilus.           

Sin embargo, existen cepas lácticas autóctonas en carnes, vegetales, leche, etc, con actividad proteolítica, lipolítica, capacidad acidificante y producción de gas que permiten mejorar o deterioran la vida útil y la calidad microbiológica del producto final. Entre los géneros típicamente aislados destacan Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y Pediococcus.           

Las BAL tienen requerimientos nutricionales específicos, son sensibles a los cambios de pH, presencia de sal, carbohidratos, vitaminas, etc. Además de los requerimientos nutricionales, la temperatura es uno de los factores más importantes que influye en el crecimiento adecuado de las BAL y en su diferenciación. Por ello, deben cultivarse a la temperatura óptima y en medios con nutrientes que favorezcan su crecimiento.

El aislamiento y cultivo cuantitativo de las bacterias lácticas se realiza en un medio sólido, selectivo y diferencial. Los medios de cultivo recomendados son: MRS (De Man, Rogosa and Sharpe agar) que favorece el aislamiento del genero Lactobacillus; M17 suplementado con azúcares para el aislamiento de los géneros Lactococcus y Streptococcus; medio MSE (Mayeux, Sandine y Ellike); y el medio KAA (Kanamicina, Aesculina, Ácido) para favorecer el crecimiento del genero Leuconostoc y Enterococcus. Sin embargo, los métodos moleculares permiten más fácilmente la detección e identificación de estas bacterias para conocer con total exactitud cuál es la cepa que se está analizando. Actualmente, para la identificación taxonómica se emplea como diana la secuencia genómica codificante del 16S rARN, pero a veces no existen diferencias suficientes en esta secuencia entre algunas especies y es necesario realizar un aislamiento previo en cultivo utilizando medios de cultivo selectivos.

Pruebas realizadas en IVAMI:

• Aislamiento y cultivo cualitativo o cuantitativo de bacterias lácticas en medios selectivos y diferenciales según el género a aislar. 

• Detección molecular cualitativa mediante PCR específica. 

• Identificación de colonias aisladas mediante métodos moleculares (PCR y secuenciación).