Haemophilus influenzae – Prueba de anticuerpos bactericidas (SBA: Serum Bactericidal Antibody assay) 

Haemophilus influenzae tipo b (Hib) es una bacteria gramnegativa patógena humana que afecta principalmente a niños menores de 5 años. Puede causar infecciones graves invasivas como meningitis, sepsis y neumonía. Además, puede causar otitis media, epiglotitis e infecciones osteoarticulares, entre otras.

Según la estructura química de los polisacáridos capsulares, H. influenzae se ha dividido en 6 serotipos (a, b, c, d, e y f). Además, existen cepas no-capsuladas que carecen del gen cap y son referidas como no-tipables, porque no se pueden tipar para ninguno de los 6 serotipos citados. De los 6 serotipos existentes, el tipo b es el más virulento a nivel mundial, y en la década de 1980s, antes de que se introdujese la vacuna frente a este serotipo, era la causa principal de meningitis en niños. El segundo serotipo en importancia es el serotipo a. Este serotipo es raro en la mayor parte del mundo, pero es prevalente en algunas regiones geográficas concretas como Norte y Oeste de Canadá, Alaska y Sur de EE.UU, afectando casi exclusivamente a pueblos indígenas.

La expresión del polisacárido capsular, un factor de virulencia, protege a la bacteria de los mecanismos de defensa, como es la bacteriolisis dependiente de complemento.

Las vacunas conjugadas de Haemophilus influenzae tipo b inducen la producción de anticuerpos frente a este polisacárico capsular, proporcionando protección frente a la enfermedad invasiva causada por este serotipo. Desde la introducción de la vacuna conjugada de Haemophilus influenzae tipo b se produjo una disminución de las infecciones graves en las que estaba implicado. En EE.UU. la vacuna se introdujo en 1988 y se consiguió una reducción que hizo que la incidencia de enfermedad invasiva en niños menores de 5 años se redujese en más del 99%.

La vacunación frente a H. influenzae tipo b no ofrece protección frente a otros serotipos de H. influenzae. En la era postvacunación frente a H. influenzae tipo b, las cepas de otros serotipos han adquirido importancia en la etiología de la enfermedad invasiva por esta bacteria. Así, el curso y gravedad de enfermedad por el serotipo a recuerda a la causada por el serotipo b.

La protección de la enfermedad por H. influenzae tipo b, se correlaciona con la presencia de anticuerpos frente al polisacárido capsular antigénico de este serotipo que corresponde a moléculas de poliribosilribitol fosfato (PRP). Algunos estudios han demostrado que el uso en las pruebas de anticuerpos bactericidas de cepas diferentes de H. influenzae tipo b, proporciona unos resultados con el mismo o éste difiere en una o dos diluciones.

Las cepas de H. influenzae no-tipables (NTHI) a diferencia de otros serotipos carecen de la cápsula polisacárida. Estas cepas son comensales de la mucosa nasofaríngea humana y puede actuar ocasionalmente como un patógeno iniciando la infección de las vías respiratorias superiores o inferiores, provocando otitis media, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y enfermedad invasiva como meningitis y sepsis, especialmente en neonatos y ancianos. Se requiere una vacuna para estas cepas, pero el principal problema es la elevada diversidad genética entre ellas, por lo que se necesita identificar los antígenos que tengan epítopos funcionales capaces de inducir anticuerpos de reacción cruzada para las distintas cepas. Se ha buscado una proteína de membrana externa y los lipooligosacáridos. Por otra parte, un antígeno protector debe expresar epítopos disponibles para la fijación de los anticuerpos en la superficie de la bacteria intacta. Las moléculas inmersas en la membrana externa o bloqueadas por uniones estéricas de estructuras adyacentes, como el ácido siálico no son asequibles para la fijación de anticuerpos y por lo tanto incapaces de generar anticuerpos protectores.

Tanto las vacunas polisacáridas como las proteicas, se han evaluado utilizando la prueba de muerte mediada por complemento en la prueba bactericida SBA (Serum Bactericidal Antibody assay). Esta prueba se desarrolló en la década de 1960s con el objetivo de determinar la presencia de anticuerpos funcionales específicos en las infecciones por Neisseria meningitidis. Los anticuerpos funcionales específicos son aquellos, que además de unirse a la bacteria, activan algún sistema biológico de defensa como puede ser la fagocitosis (opsonofagocitosis), o la activación del sistema del complemento. Cuando los anticuerpos específicos se unen a la bacteria se producen modificaciones en la estructura de los anticuerpos (región Fc) que promueven la activación del sistema del complemento comenzando por la fijación de la subunidad C1q y posteriormente ocurre la activación de toda la cascada de subunidades y factores (C1q, r, s; C4; C2; C3; C5; C6; C7; C8 y C9). Una vez que se han activado todos los factores secuencialmente, se provoca la lisis y la muerte bacteriana. En los diferentes ensayos para determinar la actividad bactericida mediada por tales anticuerpos, con la participación del sistema del complemento, propuestos por distintos autores, todos tienen en común tres elementos: bacteria, anticuerpos y complemento. Los métodos de actividad bactericida sérica (SBA) difieren en el número de bacterias (UFC) utilizadas; en el tampón utilizado durante el ensayo; el crecimiento de la cepa utilizada; el tiempo de incubación del ensayo; la fuente de complemento, humano o de conejo; y la dilución de comienzo del suero. Este método tradicional (mSBA: colony counting microassay Serum Bactericidal Assay) se considera muy laborioso e inadecuado cuando deben de estudiarse numerosas muestras, por lo que conlleva de siembras y contaje de bacterias. Por estas razones, se han propuesto métodos alternativos que utilizan algún sistema para facilitar la lectura de los resultados, como son: uso de trifeniltetrazolio (TTCmSBA) para visualizar los resultados mediante el cambio de coloración de este elemento en lugar contar las bacterias; o uso de un método colorimétrico (cSBA) basado en la capacidad de degradas algún sustrato, que en presencia de un indicador de pH permite estimar el crecimiento de las bacterias supervivientes.

Existen niños con títulos elevados de anticuerpos por ELISA y baja actividad bactericida sérica, y viceversa (Townsend y col. Evaluation and validation of a serum bactericidal antibody assay for Haemophilus influenzae type b and the threshold of protection. Vaccine, 2014, 32: 5650-5656). Ello es debido a que el método ELISA no diferencia entre anticuerpos funcionales y no funcionales. Por esta razón para poder determinar la existencia de anticuerpos funciones se requiere realizar la prueba SBA (Serum Bactericidal Antibody assay).

En varios estudios, se definió como punto de corte de título protector un título de anticuerpos ≥1:4. Posteriormente, Borrow y col. (Serological basis for use of meningococcal serogroup C conjugate vaccines in the United Kingdom: reevaluation of correlates of protection. Infect Immun. 2001, 69: 1568-1573), establecieron la correlación de los resultados de la prueba según se utilizara suero humano o suero de conejo como fuente de complemento, proponiendo para el caso de utilizar suero de conejo un punto de corte de protección un título de anticuerpos ≥1:8. Otros autores, con un criterio más conservador, utilizando suero humano como fuente de complemento, propusieron el punto de corte de protección en un título ≥1:8 (Donelly, J. y col., Qualitative and quantitative assessment of meningococcal antigens to evaluate the potential strain average of protein based vaccines. PNAS, 2010, 107: 19490-19495).

En el método de actividad bactericida sérica (SBA: Serum Bactericidal Antbody assay) frente a Haemophilus influenzae tipo b, el título de anticuerpos funcionales se determina en presencia de complemento humano o de conejo, utilizando diluciones de suero que son enfrentadas a una suspensión de Haemophilus influenzae  (capsulado), y tras un periodo de incubación, se les agrega complemento, volviéndose a incubar y detectando la muerte de las bacterias, en su caso, mediante la siembra en placa y el recuento posterior de las bacterias supervivientes.

Pruebas realizadas en IVAMI

  • Prueba de anticuerpos bactericidas frente a Haemophilus influenzae tipo b u otros tipos  (SBA: Serum Bactericidal Antobody assay) con un método de recuento de colonias, utilizando suero de conejo joven.

Tipo de muestra

  • Suero o preparado de inmunoglobulinas (2 mL).

Conservación de la muestra

  • Refrigerada: 24 a 48 horas.
  • Congelada: más de 48 horas.

Plazo de entrega

  • 3 a 4 días.

Coste de la prueba