Genotoxicidad. Prueba in vitro de mutación de genes celulares de mamíferos (In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test using the Hprt and xprt genes) – Normas ISO 10993-3: 2014 (Biological Evaluation of Medical Devices, Part 3: Test for Genotoxicity, Carcinogenicity and Reproductive Toxicity) y OECD 476: 2016 (In vitro mammalian cell gene mutation test using the Hprt and xprt genes).

Prueba acreditada por ENAC.

Prueba con el certificado de Buenas prácticas de laboratorio (BPLs) Nº. 1/18-C.VAL (Dirección General de Farmacia y Productos Sanitarios; Generalitat Valenciana).

La norma ISO 10993-3: 2014 indica estrategias y pruebas para identificar los riesgos de genotoxicidad, carcinogenicidad y toxicidad reproductiva aplicables para evaluar el potencial de los dispositivos médicos (productos sanitarios) para provocar genotoxicidad, carcinogenicidad y toxicidad reproductora. Estas pruebas pueden realizarse utilizando células de mamíferos, bacterias, levaduras u hongos filamentosos para determinar si las muestras sometidas a las pruebas pueden inducir mutaciones de genes, alterar la estructura cromosómica o provocar otros cambios en el ADN.

La norma ISO 10993-1: 2009/2010, indica cuándo deben considerarse estas pruebas en la evaluación biológica de seguridad de un dispositivo médico (producto sanitario). En esta norma se indica que las pruebas de genotoxicidad no son necesarias para los dispositivos médicos (productos sanitarios) y sus componentes, cuando se conozca que no poseen genotoxicidad. Las pruebas están indicadas cuando los materiales incluidos en los dispositivos médicos puedan tener componentes que puedan interaccionar con el material genético, o cuando la composición química del dispositivo médico se desconoce.

Para realizar las pruebas de genotoxicidad pueden utilizarse varios tipos de pruebas in vitro, bien en serie de dos pruebas o de tres pruebas. Cuando se opte por la realización de tres pruebas éstas incluirán: una prueba para mutaciones génicas utilizando bacterias (OECD 471), una prueba para mutaciones génicas utilizando células de mamíferos (OECD 476), y una prueba de clastogenicidad utilizando células de mamíferos (OECD 473). Cuando se opte por la realización de dos pruebas, se requerirá una prueba para mutaciones génicas utilizando bacterias (OECD 471) y una prueba para mutaciones génicas utilizando células de mamíferos (OECD 476), pero en la que se realice la determinación del número de colonias y su tamaño con vistas a cubrir ambos tipos de objetivos (mutaciones génicas y clastogenicidad). Si los resultados de las pruebas in vitro son negativos no está indicado habitualmente realizar pruebas en animales.

La función primaria de las pruebas de genotoxicidad es investigar, utilizando células u organismos, el potencial de los productos ensayados para inducir cambios genéticos en humanos que puedan transmitirse a futuras generaciones. Los datos científicos apoyan en general la hipótesis de que los daños en el ADN de las células somáticas son críticos para el inicio del cáncer, por lo que estas pruebas pueden identificar sustancias químicas con potencial carcinogénico. Hasta donde conocemos, no existe un acuerdo internacional de cuál es la mejor combinación de pruebas para un fin concreto. Los métodos más recomendados son los descritos por las normas OECD 471 y OECD 476.

En la prueba OECD 476: 2016, in vitro de mutación de genes celulares de mamíferos (In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test using the Hprt and xprt genes), se detectan mutaciones génicas inducidas por sustancias químicas utilizando células eucariotas. Para la prueba HPRT, pueden utilizarse varios tipos de líneas celulares como las células CHO, CHL y V79 de células de hámster (Chinese hámster cells), las células L5178Y de linfoma de ratón, o las células TK6 (linfoblastoides humanas). Para la prueba XPRT (gen gpt) pueden utilizarse las células AS52 derivadas de las CHO, que contienen el transgen gpt y carecen del gen Hprt que ha sido delecionado). Estas últimas células no pueden utilizarse para la prueba HPRT porque carecen del gen hprt. Estas líneas celulares pueden desarrollar una mutación en el gen hprt (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase), así como mutaciones transgénicas del trangen gpt (Xanthine-guanine phosphoribosyl transferase). Las pruebas de mutaciones de los genes hprt y gpt detectan diferentes espectros de afectaciones génicas. La localización autosómica del trangen gpt permite detectar afectaciones génicas (deleciones) no detectables en el locus hprt del cromosoma X. Actualmente, la norma OECD 476 preconiza la detección de mutaciones en los genes hprt y gpt.

Las pruebas in vitro de mutaciones génicas de genes de células de mamíferos, utilizan líneas celulares establecidas. Estas células se han seleccionado basándose en su capacidad de crecimiento en cultivo y en su estabilidad génica en cuanto a la frecuencia de mutaciones espontáneas. Las pruebas in vitro pueden requerir el uso de un activador metabólico exógeno, aunque éste no puede simular completamente las condiciones in vivo. Deben evitarse condiciones que puedan no reflejar la mutagénesis intrínseca propia de las células, como podrían ser las variaciones en el pH, en osmolaridad, interacciones con componentes del medio de cultivo y citotoxicidad debida a altas concentraciones de la sustancia probada. Muchos compuestos para los que se detecta un potencial mutagénico con esta prueba son carcinógenos de mamíferos, pero no existe una correlación perfecta entre estos resultados y la carcinogenicidad.

Las células con Hprt (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase gene) (en la prueba HPRT) o con gpt (guanine phosphoribosyl transferase transgene -gpt) (en la prueba XPRT), son sensibles a la acción de 6-tioguanina (6-thioguanine –TG-), por lo que no pueden desarrollarse en su presencia. Sin embargo, cuando mutan se seleccionan por su resistencia al análogo de nucleótido 6-tioguanina (6-thioguanine). Las pruebas para detectar mutantes Hprt y gpt detectan cambios genéticos diferentes. Las mutaciones detectadas por la prueba HPRT pueden corresponder a sustituciones de nucleótidos, desplazamientos –frameshifts-, pequeñas deleciones o inserciones situadas en el cromosoma X. Sin embargo, la localización autosómica (no en cromosoma X) del transgen gpt (en el caso de XRTP) permite la detección de grandes deleciones y posiblemente de recombinaciones mitóticas no detectadas en la prueba HRTP ya que el gen Hprt se encuentra en el cromosoma X.

Para realizar la prueba, la suspensión celular o los cultivos en monocapa, según el tipo de células utilizadas, se exponen a la sustancia de prueba, con y sin activación metabólica, durante un periodo de tiempo adecuado y se subcultivan para determinar si se han inhibido por incorporar los análogos de nucleótidos o si por el contrario no son inhibidas por haber mutado en presencia del análogo utilizado. La citotoxicidad se determina midiendo la eficiencia relativa de clonación (supervivencia) o el crecimiento total relativo de las células de un cultivo después del periodo de exposición. Las células tratadas se mantienen en medio de crecimiento durante un periodo de tiempo suficiente, característico para cada locus y tipo de células, para permitir la expresión fenotípica de las mutaciones inducidas.

La frecuencia de mutantes se determina sembrando un número conocido de células en medio con el agente selectivo para determina la presencia de las células mutadas, así como en un medio de cultivo sin el agente selectivo para determinar la eficiencia de clonación (viabilidad). Después de un periodo de tiempo se cuentan las colonias y la frecuencia de mutación se obtiene a partir del número de colonias de mutantes en medio selectivo y del número de colonias en medio no-selectivo. En la prueba deben utilizarse al menos 4 concentraciones analizables que en caso de existir citotoxicidad cubran un rango máximo con escasa o nula toxicidad, así como los controles positivos con sustancias conocidas capaces de inducir mutaciones, tanto en ausencia o en presencia de un activador metabólico exógeno. Las exposiciones deben realizarse entre 3 y 6 horas por duplicado, incluyendo los controles negativos por duplicado. Tras la exposición, las células son lavadas y cultivadas para determinar su supervivencia en presencia del agente selectivo (6-tioguanina –TG-) y permitir que se desarrolle el fenotipo mutante en caso de estar presente. La medida de la mutagénesis se determina según la eficiencia relativa de clonación (supervivencia) o el crecimiento relativo total de los cultivos, sembrando en un medio selectivo y en un medio no selectivo. Cada locus investigado tiene un tiempo mínimo requerido que es de al menos 7 a 9 días. La capacidad mutagénica de un producto depende de la frecuencia de mutación relacionada con la concentración o el aumento reproducible de la frecuencia de mutación. Si no se incrementa, la sustancia probada no se considera mutagénica.