Prueba de fototoxicidad. OECD 432: 2004. In vitro 3T3 NRU phototoxicity test (prueba de fototoxicidad in vitro con células 3T3 y captación de rojo neutro).

 

Prueba acreditada por ENAC.

Prueba con el certificado de Buenas prácticas de laboratorio (BPLs) .

 

La fototoxicidad se define como una respuesta tóxica inducida por una sustancia, que se produce o se incrementa después de la exposición corporal a la luz, o que se induce por la irradiación de la piel después de la administración sistémica, o cutánea tópica de una sustancia.

La prueba de fototoxicidad 3T3 in vitro con captación de rojo neutro se utiliza para identificar el potencial fototóxico de una sustancia de ensayo provocada por la sustancia química excitada después de la exposición a la luz. La prueba evalúa la fotocitotoxicidad por la reducción relativa en la viabilidad de las células expuestas a la sustancia química en presencia de luz solar frente a la viabilidad en ausencia de luz. Las sustancias identificadas por esta prueba es probable que sean citotóxicas in vivo, tras la administración sistémica y su distribución a la piel o después de la aplicación tópica cutánea.

La prueba de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU está basada en la comparación de la citotoxicidad de una sustancia química cuando se prueba en presencia y ausencia de exposición a dosis no-citotóxicas de luz solar simulada. La citotoxicidad en esta prueba se expresa como una reducción concentración-dependiente de la captación del colorante vital rojo neutro cuando se mide 24 horas después del tratamiento con la sustancia química y de haberse irradiado. El rojo neutro es un colorante catiónico débil que penetra a través de las membranas celulares por un mecanismo sin difusión, acumulándose intracelularmente en los lisosomas. Las alteraciones de la superficie celular de la membrana lisosomal que provoca la fragilidad de los lisosomas y otros cambios irreversibles, conducen a una disminución de la captación y fijación del rojo neutro. Así es posible distinguir entre células viables, dañadas o muertas, que es la base de esta prueba.

En la prueba se utilizan células Balb/c 3T3 que se mantienen en cultivo durante 24 horas para obtener las monocapas de células. En cada prueba se utilizan dos placas de 96 pocillos con las monocapas celulares, cada una de ellas preincubadas con 8 concentraciones diferentes de la sustancia sometida a la prueba durante 1 hora. A continuación, una de las dos placas se expone a la irradiación lumínica más elevada que no sea citotóxica, mientras que la otra microplaca se mantiene en oscuridad. En ambas placas el medio de tratamiento conteniendo la sustancia sometida a evaluación se sustituye por medio de cultivo y después de 24 horas de incubación se determina la viabilidad celular mediante la captación del colorante rojo neutro. La viabilidad celular se expresa como el porcentaje de viabilidad celular para cada concentración respecto a los controles no tratados con la sustancia química evaluada. Para predecir el potencial fototóxico, se comparan las respuestas a las concentraciones de la sustancia obtenida en presencia y en ausencia de irradiación lumínica, generalmente a nivel de la concentración inhibidora 50% (IC50), es decir, la concentración que reduce la viabilidad celular al 50% comparado con los controles no tratados. Con este valor (IC50) se calculará el valor PIF (factor de irritación lumínica).