Pruebas de citotoxicidad en Odontología. EN ISO 7405: 2019 - Biocompatibilidad de los productos sanitarios utilizados en Odontología. 

Prueba no acreditada en nuestro laboratorio.

Prueba con el certificado de Buenas prácticas de laboratorio (BPLs).

La norma ISO 7405 especifica los métodos de ensayo utilizados en la evaluación de los efectos biológicos de los productos sanitarios que se utilizan en odontología. Se debe utilizar conjuntamente con la serie de las normas ISO 10993, pero este documento contiene ensayos especiales, que reconocen las necesidades especiales de la odontología. Este documento especifica los métodos de ensayo utilizados en la evaluación de los efectos biológicos de los productos sanitarios que se utilizan en odontología.

La selección de los métodos de ensayo se debe basar en la utilización prevista del tejido sanitario, el/los tejidos con el/los que el producto puede entrar en contacto y la duración del contacto. Los ensayos se clasifican en tres grupos, el grupo 1 comprende los ensayos de citotoxicidad in vitro, que incluyen: 1) el ensayo de difusión en agar, 2) el ensayo de difusión en filtros, 3) el ensayo de contacto directo o de un extracto de acuerdo con la norma ISO 10993-5 y 4) el ensayo de citotoxicidad de barrera de dentina. Mientras los tres primeros ensayos pueden emplearse con todos los productos sanitarios en odontología, la prueba de barrera de dentina únicamente puede emplearse con dispositivos de comunicación externos.

El ensayo de difusión en agar (apartado 6.2 de la norma), está diseñado para demostrar la citotoxicidad inespecífica de los materiales de ensayo después de la difusión a través de agar. Este ensayo no es apropiado para lixiviables que no difundan a través de agar. Sobre un cultivo celular de células epiteliales o fibroblastos se deposita una capa de agar con medio de cultivo y una solución del colorante vital rojo neutro. Sobre cada placa se aplica un número apropiado de muestras de ensayo para realizar el ensayo con cada producto sanitario, el control negativo y el control positivo, y se incuban durante 24 horas a 37ºC. Cada material de ensayo debe analizarse por cuatriplicado. La norma también incluye como control opcional un material de referencia. Si se desea que se realice el ensayo con un material de referencia de similares características al producto de ensayo, este debe ser proporcionado por el cliente. Se evalúa la presencia de zonas de decoloración de la monocapa celular (no teñida con rojo neutro) y lisis celular, alrededor y debajo de las muestras, calculando el índice de decoloración y de lisis, respectivamente. La respuesta celular, calculada como la media del índice de decoloración y del índice de lisis, determinará si el producto sanitario es no citotóxico, medianamente citotóxico, moderadamente citotóxico o intensamente citotóxico.

El ensayo de difusión en filtro (apartado 6.3 de la norma) tiene como objetivo demostrar la citotoxicidad inespecífica de los materiales de ensayo después de su difusión a través de un filtro de acetato de celulosa. Sobre un filtro de acetato de celulosa colocado en una placa de cultivo, se inocula una suspensión celular de fibroblastos o células epiteliales y se incuban durante 24 horas a 37ºC. En placas de cultivo se añade una mezcla de agar con medio de cultivo recién preparada y se coloca el filtro sobre la parte superior de la mezcla solidificada, con el cultivo celular hacia abajo. Se depositan de 3 a 5 muestras de ensayo sobre cada filtro y se incuban a 37ºC evaluando la evidencia de citotoxicidad tras 2 y 24 horas. Cada material de ensayo se analiza al menos por cuatriplicado. Además, en cada placa se incluye un control positivo y un control negativo, y se analizan otros controles del método de prueba proporcionados por el cliente si se desea que se incluyan. La norma también incluye como control un material de referencia, si se desea que se realice el ensayo con un material de referencia de similares características al producto de ensayo, este debe ser proporcionado por el cliente. Tras la incubación, se desprende el filtro de la agarosa y se evalúa citoquímicamente el área de la actividad reducida de la enzima succinato deshidrogenasa (método A) o de la hidrolasa inespecífica (método B) mediante la tinción del filtro. La valoración del daño celular se basará en el área de decoloración en la superficie del filtro, determinando si el producto sanitario es no citotóxico, medianamente citotóxico, moderadamente citotóxico o intensamente citotóxico.

El ensayo de contacto directo o de un extracto del producto sanitario de acuerdo con la norma ISO 10993-5 consiste en poner en contacto un producto o un extracto del mismo con una monocapa de celular (si el cliente no indica otra preferencia, será de células Vero). Tras 24 a 48 horas se evalúa la citotoxicidad por el método cualitativo (observación de los efectos microscópicos, clasificando la reactividad como ninguna, leve, suave, moderada o severa) y mediante un método cuantitativo, la determinación de la viabilidad celular mediante el recuento de células viables para productos de contacto directo o por uno de los tres métodos indicados por la norma (NRU, MTT o XTT) para analizar extraídos y determinar el índice de muerte celular que, cuando es superior al 30%, indica citotoxicidad. En IVAMI, de forma habitual se utiliza el método con rojo neutro. Solicitar la información específica de la norma ISO 10993-5 si se desea que se realice el ensayo bajo este método.

El ensayo de citotoxicidad de la barrera de dentina (Anexo B de la norma) está diseñado como una simulación in vitro de la cámara pulpar sobre la filtración y difusión de los materiales desde una preparación de la cavidad dental hasta la pulpa dental. Está diseñado para demostrar un cambio en las concentraciones de los componentes de los materiales de ensayo o de extractos o fraguados cuando se colocan en un lado de la cámara de perfusión, en uno de los lados de una barrera de dentina de origen humano o bovino, y permite que se difundan al lado opuesto. Una malla con células se coloca en el lado opuesto de la dentina. Se deben emplear células cuya fisiología sea similar a los tejidos de la pulpa dental, por ejemplo, células clonales por transfección del antígeno T del virus SV40, derivadas por ejemplo de la papila dental bovina. Tras el ensayo, se determina la viabilidad celular de las células de la malla empleando el colorante MTT. Se realizan de 5 a 10 réplicas del material de ensayo, control positivo y control negativo. La evaluación de la citotoxicidad se basa en una comparación estadística de los resultados obtenidos. Dependiendo si el material de rensayo muestra o no diferencias significativas con el control positivo o negativo, el producto sanitario se clasificará como no citotóxico, moderadamente citotóxico o intensamente citotóxico. Este ensayo no se realiza actualmente en nuestro laboratorio.