Instituto Valenciano de Microbiología
(I V A M I)

Virus linfotrópicos de células T humanas tipo 1 y 2 (HTLV-1 y HTLV-2) –

Anticuerpos; Confirmación de anticuerpos; Diagnóstico molecular (ARN por RT-PCR y ADN proviral por PCR)

Información 27-05-18.

Tanto el HTLV-1 como el HTLV-2 tienen una distribución mundial y están incluidos en las estimaciones de prevalencia en todo el mundo. Se estima que existen entre 10-20 millones de personas infectadas por HTLV-1 en todo el mundo, mayoritariamente en Japón y la Cuenca del Caribe. La distribución de HTLV-1/2 es heterogénea, encontrándose áreas de elevada endemicidad y otras zonas donde estos retrovirus tienen escasa o nula presencia. El HTLV-1 es endémico en Japón, el África subsahariana, América del Sur y el Caribe. Mientras el HTLV-2 es endémico entre aborígenes de América Latina y algunas tribus de África, y prevalece entre usuarios de drogas en Europa y América del Norte.

La estructura de los virus HTLV-1 y -2 consiste en una envoltura lípido-proteica y una nucleocápside central denominada “core”, donde se encuentra localizado el material genético y ciertas enzimas necesarias para su ciclo vital, entre ellas la transcriptasa reversa. El material genético de los retrovirus HTLV-1/2 está constituido por dos moléculas idénticas de ARN de cadena simple y polaridad positiva. El genoma del HTLV-1 consta de 9.032 nucleótidos y el de HTLV-2 de 8.932. Está compuesto por los genes gag, pol y env, que codifican las proteínas internas, las enzimas y las proteínas de envoltura, respectivamente. Además, el genoma de estos virus incluye una región denominada “X”, que codifica proteínas reguladoras de la replicación vírica, entre ellas Tax, Rex y HBZ. Esta región “X” está separada del fragmento principal, que codifica para el resto de proteínas, por una región silenciosa, no traducida a proteínas. Además, el ARN genómico está flanqueado a ambos lados por secuencias repetitivas terminales largas (long terminal repeats, LTR), que tienen un papel importante en la integración del ADN proviral del HTLV-1/2 en el genoma de la célula que infectan.

Los HTLVs producen una infección persistente y lenta en el huésped que infectan, y se transmiten verticalmente y horizontalmente mediante la transferencia de linfocitos infectados por transmisión perinatal, lactancia materna, contacto sexual, transfusión sanguínea y uso de drogas intravenosas. La infección comienza con la adsorción del virus, que ocurre a través de receptores de superficie celular que reconocen a las glicoproteínas de la envoltura viral, principalmente la gp46. Ambos virus utilizan los receptores celulares GLUT-1 y neuropilina-1 (NRP1) para su entrada a la célula del hospedador, aunque HTLV-1, pero no HTLV-2, depende de los proteoglicanos de heparán sulfato. A pesar de que el uso de receptores permite que HTLV-1 y HTLV-2 puedan infectar diferentes tipos de células in vitro, in vivo exhiben tropismos celulares distintivos: el HTLV-1 infecta principalmente linfocitos T CD4 +, mientras que las células T CD8 + son el objetivo preferido del HTLV-2. No obstante, también pueden ser detectados en otros tipos celulares, como células dendríticas, monocitos, macrófagos, fibroblastos y linfocitos B.

Una vez dentro de la célula del hospedador, una de las cadenas de ARN de los virus es transcrita a ADN por medio de la transcriptasa reversa. Este ADN complementario se integra, en forma de provirus, en el genoma de la célula huésped, del linfocito T. Después de integrado como provirus al genoma celular, los HTLVs se multiplican mayoritariamente por expansión clonal de la célula huésped, a partir de la mitosis de las células que infecta. De esta manera se produce una expansión clonal utilizando las enzimas celulares, ADN polimerasas con capacidad de corrección de errores. Además, también se produce la transmisión de célula a célula mediante la formación de una sinapsis viral, la cual implica un contacto célula-célula, con polarización del centro organizador de los microtúbulos y liberación direccional de viriones desde la célula infectada a la no infectada. Por ello, a diferencia del HIV que posee una variabilidad genómica importante, los HTLVs son relativamente estables. La escasa variabilidad genética se debe principalmente a la ausencia o baja frecuencia de ciclos replicativos utilizando la transcriptasa reversa viral, conocida por introducir mutaciones en alta frecuencia. Esta característica determina que la infectividad asociada a las partículas libres extracelulares sea muy baja y promueve la persistencia de la infección en el organismo al evadir la respuesta inmune del huésped. Los estudios realizados indican que al inicio de la infección con HTLV-1 existe una fase de replicación activa, donde tanto el mecanismo de expansión clonal vía mitosis, y la replicación vía transcriptasa reversa participan activamente en la progresión de la infección. Sin embargo, el hospedador desarrolla una respuesta inmunológica dirigida contra las células en las que se está transcribiendo el virus y que producen proteínas víricas. En concreto, la diana principal parece ser el producto del gen tax, que se expresa en la superficie celular de los linfocitos infectados dentro del contexto del sistema HLA. Es por ello, que se ha postulado un sistema de regulación Tax/Rex/HBZ en el cual Tax activa a HBZ y a la vez esta proteína, reprime la regulación de los mecanismos de transcripción mediados por Tax/Rex. Por lo tanto, durante la infección por HTLV-1, cuando la expresión de Tax/Rex es robusta y dominante sobre HBZ, se produce la infección productiva con expresión de proteínas estructurales y la hiperactivación de NF-κB, que induce la senescencia de las células. Sin embargo, cuando la expresión de Tax/Rex es silenciada y HBZ es dominante, se establece la infección latente con expresión de proteínas reguladoras (Tax/Rex/HBZ), pero no estructurales. Así, HBZ mantiene la latencia viral mediante la regulación negativa de la activación de la senescencia inducida por Tax, y al inhibir la expresión mediada por Rex de proteínas estructurales virales. Este silenciamiento constituiría una forma de escape a la respuesta inmune por parte de las células infectadas, que hace que el virus sólo pueda perdurar en forma provírica silente y perpetuarse mediante la mitosis celular. La regulación e interacción de las proteínas Tax/HBZ, es además, un importante factor en el desarrollo de la oncogénesis del HTLV-1. Ambas proteínas pueden promover la proliferación e inmortalización de las células T infectadas. De hecho, se piensa que las diferencias entre las proteínas reguladoras Tax1 y Tax2, codificados por HTLV-1 y -2, respectivamente, pueden ser responsables de las diferentes patogenicidades de los retrovirus. El regulador Tax2 carece del motivo de unión al dominio PDZ (PBM) presente en Tax1 e importante para la actividad de transformación celular.

El diagnóstico de la infección por HTLV puede hacerse por métodos directos o indirectos. Los métodos indirectos son los más utilizados y se basan en el reconocimiento de anticuerpos específicos frente a proteínas del virus, en suero u otros líquidos biológicos. Las técnicas más comunes para detectar anticuerpos anti-HTLV son los enzimoinmunoensayos (EIA). Sin embargo, estos métodos son incapaces de discriminar si la infección está causada por HTLV-1 o HTLV-2. Por este motivo, todos los resultados positivos deben ser confirmados por técnicas más específicas, como el western blot (WB), la inmunofluorescencia indirecta o la radioinmunoprecipitación, que son capaces de reconocer cada uno de los anticuerpos dirigidos frente a las diferentes proteínas de ambos virus. Por otro lado, los métodos que demuestran la presencia del virus de forma directa son el cultivo vírico y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR es una técnica de biología molecular de gran sensibilidad y especificidad que permite detectar no sólo la presencia de partículas extracelulares de los HTLVs mediante la detección del ARN del virus, indicativo de que el virus se encuentra en fase de replicación activa, sino también, la detección del virus integrado en los linfocitos mediante la detección del ADN complementario viral. Debido a la mínima o ausente fase extracelular del HTLV-1/2 in vivo, al no emplear su transcriptasa reversa en su fase de expansión en el sujeto infectado, la detección del ADN proviral de estos virus es una importante herramienta para la determinación de la infección. Se han comunicado casos de PCR positiva para HTLV-1 y HTLV-2 en ausencia de seropositividad, o con patrones indeterminados en el WB, particularmente en sujetos inmunodeprimidos coinfectados por el VIH, y en pacientes con enfermedades neurológicas. Por ello, en los casos indeterminados o HTLV sin tipificar por WB, se recomienda emplear una reacción en cadena de la polimerasa anidada para confirmar la infección.

Pruebas realizadas en IVAMI:

• Detección molecular del ARN de los virus HTLV-1 y 2 (RT-PCR).
• Detección molecular del ADN proviral de los virus HTLV-1 y 2 (PCR).
• Detección de anticuerpos frente a los virus HTLV-1 y 2 (EIA).
• Confirmación de anticuerpos frente a los virus HTLV-1 y 2 (WB).

Muestra recomendada:

• Para la detección de anticuerpos y confirmación se aceptan muestras de plasma o suero (1 mL).
• Para la detección del ARN de HTLV-1/2, se aceptarán muestras de plasma o suero extraídos con EDTA(1 mL), sangre total extraída con EDTA (5 mL), o líquido cefalorraquídeo (volumen mínimo de 0,5 mL)
• Para la detección del ADN proviral de HTLV1/2, se aceptarán muestras de sangre total extraída con EDTA (10 mL), o líquido cefalorraquídeo (volumen mínimo de 0,5ml, aunque se recomienda un volumen superior).
• Nota: Para la determinación del ADN proviral se deben aislar o concentrar los linfocitos presentes en las muestras de sangre o LCR, por lo que es importante que se respeten los volúmenes de muestra requeridos y las condiciones de conservación (refrigeración durante un tiempo inferior a 24-48h).

Conservación y envío de la muestra:

• Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días, o congelada si el periodo de conservación es superior.

• En el caso de enviar sangre total extraída con EDTA (para la detección de ARN o ADN proviral), o LCR (detección de ADN proviral), la muestra debe conservarse refrigerada, no congelada, y llegar a nuestro laboratorio en un periodo no superior a 24 horas. En el laboratorio se procederá a la separación del plasma para la detección de ARN viral o a la separación de las células mononucleares (PBMCs) para la detección de ADN proviral.

Plazo de entrega de resultados:

• Detección molecular del ARN de HTLV-1/2 (RT-PCR): 24 a 48 horas.
• Detección molecular del ADN proviral de HTLV-1/2 (PCR): 24 a 48 horas.
• Detección de anticuerpos frente a los virus HTLV-1 y 2 (EIA): 5 días.
• Confirmación de anticuerpos frente a los virus HTLV-1 y 2 (WB): 5 días.

Coste de la prueba:  

• Detección molecular del ARN de HTLV-1/2 (RT-PCR ): Consultar a ivami@ivami.com
• Detección molecular del ADN proviral de HTLV-1/2 (PCR): Consultar a ivami@ivami.com
• Detección de anticuerpos frente a los virus HTLV-1 y 2 (EIA): Consultar a ivami@ivami.com
• Confirmación de anticuerpos frente a los virus HTLV-1 y 2 (WB): Consultar a ivami@ivami.com