Comparación de secuencias genómicas de virus de hepatitis C en muestras de plasma. Análisis filogenéticos
Información 06-11-15.
El virus de la hepatitis C (Hepacivirus, Flaviviridae), es un virus con genoma ARN monocatenario de signo positivo (+ ssRNA) con una ARN-polimerasa-ARN-dependiente (RNAd-RNAp), que carece de mecanismos de corrección por lo que la replicación del virus está sujeta a errores. Estos errores se calculan que ocurren con una frecuencia de 2,5 x 10-5 mutaciones/nucleótido en cada replicación del genoma viral. Estos errores en muchos casos dan lugar a un virus incapaz de continuar su replicación y configuración. Sin embargo, muchas de las nuevas réplicas si pueden continuar, y dan lugar a una diversidad de virus dentro de un mismo hospedador (individuo), que por una parte favorece los mecanismos de evasión de la respuesta inmunitaria, y que también puede condicionar la resistencia a los antivirales. Este hecho, de la diversidad viral dentro de un mismo hospedador es importante tenerlo en cuenta para poder entender la comparación de los virus de la hepatitis C presente en dos individuos.
En la secuencia de nucleótidos del genoma de este virus existe una diversidad importante, pero dentro de ella, al menos el 68 a 79% de la secuencia es compartida entre diferentes cepas. Sin embargo el resto de la secuencia 20 a 30%, aproximadamente, puede diferir, y por esta razón los virus de la hepatitis C se diferencian en genotipos y en subtipos, según el grado de diferencias existentes entre ellos. Se conocen 6 genotipos de virus de la hepatitis C (1 a 6), y más de 100 subtipos distribuidos entre los 6 genotipos. Los genotipos/subtipos 1a, 1b, 2a, 2c y 3a, representan más del 90% de los virus productores de hepatitis C en Europa, Norteamérica, Sudamérica, Rusia, China, Japón, Australia y Nueva Zelanda. En el Norte de África, Egipto, África Central y Oriente Medio, predomina el genotipo 4; en Sudáfrica predomina el genotipo 5, y en el Sudeste Asiático el genotipo 6.
El genoma de este virus está subdividido en varias regiones genómicas (5´-NCR, C, E1 y E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, NCR-3´). La variabilidad de cada una de estas regiones genómicas de unos virus a otros no varía de la misma forma, y por ello, se habla de regiones conservadas (que cambian poco de unas cepas a otras), de regiones semiconservadas (que cambian parcialmente entre distintas cepas), y variables o hipervariables (que cambian algo o bastante entre las distintas cepas).
La ausencia de mecanismos de corrección de la ARN-polimerasa durante la replicación del virus, hace que se vaya acumulando esa diversificación en la secuencia de nucleótidos de las distintas regiones genómicas del virus, que al acumularse ha dado lugar a los distintos genotipos y subtipos. A menor escala, es decir sin que tengan que existir tantas diferencias como para considerarse un genotipo o subtipo distinto, dentro de un mismo genotipo y subtipo, existen en un individuo infectado poblaciones de virus que se diferencian en su secuencia de nucleótidos, aunque no sean tan numerosas, y que podamos hablar de quasispecies (casi especies distintas aunque no lleguen a serlo).
Cuando un individuo se infecta con un virus de la hepatitis C, lo puede hacer con una cepa de un genotipo/subtipo concreto, y al mismo tiempo con una o más de las quasispecies que tuviese el individuo infectante.
Comparación entre cepas de virus de hepatitis C entre distintos pacientes infectados
La comparación de secuencias genómicas de ARN de virus de hepatitis C, está recomendada cuando se desea conocer si los virus que infectan a dos o más personas son similares.
Al plantearse realizar la comparación hay que tener en cuenta los hechos citados previamente respecto a genotipo, subtipo y quasispecies.
Por esta razón, lo primero que debe comprobarse es si los virus que infectan a dos, o más individuos, son del mismo genotipo y subtipo. Si son distintos, lógicamente no cabe plantearse ningún tipo de comparación adicional. Por esta razón la primera prueba indicada es la determinación del genotipo/subtipo del virus. Esta prueba se realiza habitualmente mediante procedimientos de amplificación y secuenciación que comparan las regiones conservadas o semiconservadas (regiones genómicas 5´-NCR o NS5B, habitualmente), aunque las diferencias en 5´-NCR pueden no ser suficientes para determinar subtipos por ser una región muy conservada.
Por otra parte, hay que tener en cuenta, como hemos comentado, que es muy raro que las cepas de dos individuos que se hayan podido infectar uno de ellos a partir del otro, sean completamente idénticas, por propia variabilidad que va generando la cepa del virus infectante durante su replicación tanto en el individuo infectante, como en el individuo infectado. Estas diferencias serán mayores cuanto más tiempo haya transcurrido desde el momento de la infección.
Además, hay que tener en cuenta que aunque dos cepas de virus de hepatitis C, obtenidas de dos individuos distintos y comparadas genéticamente, permitan establecer una similitud entre ellas, podría haberse dado la casualidad de que hubiesen sido infectados a partir de un origen distinto cada uno y con un virus idéntico de los que están presentes en los individuos infectados.
Por esta razón, se admite en general, que los análisis filogenéticos sirven fundamentalmente, para apoyar otras líneas de evidencias, como pueden ser las epidemiológicas, que justifique que se han dado las circunstancias, contactos, manipulaciones diagnóstico-terapéuticas, que justifique que ambos individuos se han podido infectar a partir de un mismo origen.
Recomendaciones de IVAMI
- Conocer que los individuos supuestamente infectados a partir de un mismo origen, poseen virus con idéntico genotipo/subtipo.
- Realizar el análisis genético comparativo de la región NS5B, y construcción del correspondiente árbol filogenético.
- Realizar el análisis genético comparativo de las regiones NS3/4A y NS5A, y construcción de los correspondientes árboles filogenéticos.
- Realizar el análisis genético de las regiones hipervariables de E1 y E2 (este análisis requiere la clonación de las secuencias de virus presentes en cada individuo ya que como hemos comentados existen muchas quasispecies).
Pruebas realizadas em IVAMI:
- Prueba de genotipo/subtipo de virus de hepatitis C (en caso de desconocerse).
- Comparación de la región genómica NS5B (amplificación y secuenciación).
- Comparación de otras regiones genómicas (NS3/4A, NS5A).
- Comparación de las regiones genómicas hipervariables E1 y E2.
Conservación y envío de la muestra:
- Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
- Congelada: más de 2 días.
Coste de las pruebas:
Consultar a ivami@ivami.com