Helicobacter pylori: resistencias genotípicas a claritromicina, amoxicilina, metronidazol, levofloxacino, tetraciclinas y rifabutina – PCR y secuenciación.
Información 18-03-16.
Helicobacter pylori es una bacteria gramnegativa de morfología espiral, capaz de colonizar el estómago humano por su potente actividad ureásica que le permite crear un ambinte neutro en su entorno gracias a la metabolización de la urea presente en las mucosa (bacteria neutralofílica).
Esta bacteria provoca una infección transmisible importante que daña las estructuras gástricas y su función. Actualmente se reconoce como responsable de enfermedad ulcerosa péptica (gástrica o duodenal), la gastritis gástrica atrófica, el adenocarcinoma gástrico, y el linfoma asociado al tejido mucoso (linfomas de tipo MALT : Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Lymphoma).
El cáncer gástrico es la segunda causa de muerte relacionada con cáncer, por lo que la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer, dependiente de la Organización Mundial de la Salud (WHO), ha clasificado a esta bacteria como un Carcinógeno de tipo I.
El tratamiento antimicrobiano de esta infección tiene como objetivo erradicar esta bacteria patógena, y con ello curar y prevenir las enfermedades asociadas. Se han propuesto varios esquemas terapéuticos que incluyen más de un fármaco, y que se han denominado según los fármacos que incluyen, terapia doble, triple o cuádruple, así como de primera línea empírica, o segunda línea, según que estén destinados a ser administrados inicialmente tras el diagnóstico clínico, o tras el fracaso terapéutico del primer grupo de fármacos.
La mayoría de las terapias frente a Helicobacter pylori son muy efectivas, pero la tasa de erradicación está afectada negativamente por el incremento de la incidencia de la resistencia antimicrobiana de esta bacteria.
Una de las recomendaciones terapéuticas empíricas de las infecciones por Helicobacter pylori es la terapia triple empírica de primera línea que incluye el uso de inhibidores de bomba de protones (PPIs : Proton Pumps Inhibitors), amoxicilina y claritromicina o metronidazol como alternativa a claritromicina. Esta terapia triple puede administrarse desde el comienzo con los tres fármacos, o bien de forma secuencial, administrando inicialmente durante 5 días un PPIs y amoxicilina, seguida por un PPIs asociado a claritromicina y metronidazol o tinidazol durante otros 5 días.
Recientemente los resultados de la eficacia de esta combinación han disminuído, obteniéndose tasas de curación únicamente del 70%. Por esta razón, se ha establecido el punto de corte (threshold) del 15 a 20% para distinguir entre las regiones con baja y alta tasa de resistencia a claritromicina. En las regiones con tasa baja de resistencia, inferiores al 15-20%, se recomienda utilizar la triple terapia de primera línea incluyendo claritromicina, pero no así en las que se encuentran tasas de resistencia superiores. En estas situaciones puede utilizarse la terapia cuádruple empírica de primera línea con cuatro fármacos: inhibidor de bomba de protones (PPIs), sal de bismuto (subsalicilato), tetraciclina y metronidazol. En esta pauta se sustituye la claritromicina por tetraciclina y se incluye una sal de bismuto. Otra alternativa es utilizar una terapia triple empírica de primera línea en la que se incluye levofloxacino (fluoroquinolona) en lugar de claritromicina.
Si a pesar de ello no se obtiene la erradicación se recomienda utilizar una terapia de segunda línea, guiada por las pruebas de sensibilidad siempre que sea posible. Para esta triple terapia de segunda línea deben considerarse las siguientes alternativas: fluoroquinolonas (levofloxacino), tetraciclinas, rifabutina, furazolidonas, y altas dosis de PPIs y de amoxicilina.
Las dificultades para el cultivo habitual de esta bacteria, y para determinar su sensibilidad antimicrobiana hacen que las terapias se administren de forma empírica, pero se recomienda que tras los fracasos trerapéuticos, se realicen pruebas de sensibilidad a los fármacos utilizados. Al no ser factible, en la mayoría de las casiones, disponer de la bacteria en cultivo para realizar las pruebas de sensibilidad, así como por la lentitud de las pruebas (10 a 14 días), se han propuesto varios métodos moleculares que tratan de detectar las mutaciones más frecuentes. Muchos laboratorios utilizan métodos comerciales, en general basados en hibridación con sondas específicas para detectar mutaciones concretas. Sin embargo, cuando existen mutaciones puntuales que pueden estar distribuidas a lo largo de un gen, estos métodos no se encuentran disponibles y se requiere la amplificación y secuenciación completa del gen. Estos métodos de amplificación y secuenciación, para cada gen implicado en el desarrollo de resistencias, están disponibles en IVAMI.
Claritromicina
Las tasas globales de resistencia al macrólido claritromicina están en aumento : 9% (1998), y 17,6 (2008) en Europa, y 7% (1998) y 27,7% (2008) en Japón.
Los macrólidos ejercen su acción fijándose a la subunidad 50S del ribosoma, concretamente interaccionando con el ácido ribonucleico ribosómico 23S (23S rRNA), e inhibiendo el proceso de la peptidiltransferasa que se encarga de formar los enlaces peptídicos entre los aminoácidos que se van incorporando, y desplaza el ribosoma a lo largo del ARN mensajero (mRNA). Cuando existen mutaciones puntuales en el 23S rRNA en la región del lugar peptidiltransferasa (dominio V del 23S rRNA), se inhibe la fijación de los macrólidos, como claritromicina, y por lo tanto no se bloquea la síntesis proteica.
La principal mutación es una transición (sustitución de un nucleótido de purina por otro nucleótido de purina) A a G en la posición 2142 (A2142G) o en la posición 2143 (A2143G), o bien una transversión (sustitución de un nucleótido de purina por un nucleótido de pirimidina) en la posición 2142 (A2142C/T ; A2143C).
Se han encontrado otras mutaciones que se han relacionado con resistencia de bajo nivel: T2182C, C2611A y T2717C. Además, se han descrito otras mutaciones cuya significación clínica no se ha comprobado : A2115G, T2117C, G2141A, G2224A, C2245T, y T2289C.
Las resistencias a los macrólidos pueden estar motivados por bombas de salida (Efflux pumps), de las que existen al menos cuatro tipos. Estas resistencias no han sido estudiadas suficientemente en esta bacteria.
Amoxicilina
Amoxicilina es un antimicrobiano incluido en las terapias triples empíricas de primera línea, junto con un inhibidor de la bomba de protones (PPIs) y claritromicina o mertronidazol. Actualmente se están describiendo resistencias para este antimicrobiano, pero en general, salvo algunas excepciones, la tasa de resistencia es inferior al 2%.
Como todos los antimicrobianos de la clase de los β-lactámicos, ejerce su acción inhibiendo a algunas de las proteínas de la membrana citoplásmica de la bacteria (PBPs: Penicillin Binding Proteins), que participan en la síntesis del peptidoglucano de la pared celular. Concretamente ejercen su acción bloqueando a aquellas PBPs con actividad de transpeptidasa en su región C-terminal, como son las PBP1, PBP2 y PBP3.
La resistencia a amoxicilina está motivada por mutaciones en el lugar de unión de los β-lactámicos a las PBPs, y confieren resistencia debido a la reducción de la fijación del antimicrobiano a ellas, por lo que no se inhibe su acción. Estas mutaciones ocurren en los genes codificantes de las PBPs citadas: gen pbp1 para la enzima PBP1; gen pbp2 para la PBP2 y gen ftsI para la PBP3. Solamente se ha encontrado alguna cepa cuya resistencia es debida a la producción de β-lactamasa.
Algunas de las mutaciones encontradas son: Val16Ile; Val45Ile; Ser414Arg; Asn562Tyr; Thr593Ala; Gly595Ser; y Ala599Thr.
Cuando las mutaciones ocurren en el gen de PBP1 y PBP3 la resistencia es más elevada que cuando las mutaciones ocurren únicamente en el gen de PBP1, o en los genes de PBP1 y PBP2. Cuando las mutaciones ocurren en los genes de las tres PPBs citadas, la CMI para amoxicilina se incrementa hasta 256 veces.
Metronidazol
El metronidazol (o su equivalente tinidazol), se ha recomendado como parte de la terapia empírica triple de primera línea, o de la terapia cuádruple de primera línea.
Además de la resistencia a claritromicina, la resistencia a metronidazol es cada vez más frecuente. La prevalencia de resistencia a metronidazol se encuentra entre el 8 y 80% según los países, siendo más elevada en los países subdesarrollados.
Este fármaco, en realidad, es un profármaco que debe activarse por reducción del grupo nitro unido al anillo imidazol. Al reducirse se generan grupos nitroso o hidroxilamina que alteran el ADN. Para que pueda reducirse el metronidazol, se requiere una nitrorreductasa NADPH oxígeno-resisente (RdxA), una oxidorreductasa NADPH tipo flavina (FrxA) y una ferredoxina (FrxB).
La resistencia a metronidazol puede deberse a la existencia de mutaciones en los genes rdxA (inserciones, deleciones, mutaciones sin sentido, …), frxA, frxB (mutaciones puntuales) o rpsU.
El gen rdxA, codifica la nitrorreductasa NADPH resistente al oxígeno. Los genes frxA y frxB codifican una enzima similar a la ferredoxina, una oxidorreductasa NADPH de tipo flavina. Las mutaciones en estos últimos genes aumentan la resistencia, en general, cuando coexisten con mutaciones del gen rdxA, pero también se ha encontrado que las mutaciones del gen frxA por sí solas pueden provocar resistencias al metronidazol. Además se ha encontrado en cepas resistentes mutaciones en el gen rpsU, que posiblemente podrían dar lugar a resistencias.
Levofloxacino
La resistencia primaria a fluoroquinolonas se encuentra entre el 2 y 22% según las regiones estudiadas.
Las fluoroquinolonas ejercen su acción inhibiendo la función de la enzima ADN-girasa. La función de esta enzima es esencial para poder mantener la estructura helicoidal superenrollada del ADN dentro de la bacteria, y además participa en la replicación del ADN y en su transcripción desenrollando secuencialmente la molécula cuando se van a producir estos procesos. La ADN-girasa es un tetrámero compuesto por dos subunidades A y dos subunidades B, codificadas, respectivamente, por los genes gyrA y gyrB. La subunidad A de la ADN-girasa es la responsable del corte y unión de las cadenas de ADN durante el proceso de desenrollamiento/superenrollamiento.
Las mutaciones se agrupan, en general, en una parte de la secuencia del gen denominada QRDR (Quinolones Resistance Detemining Region), que al mutar cambian la secuencia de aminoácidos de la enzima. Estos cambios evitan que se unan a ella las fluoroquinolonas dando lugar a la resistencia.
En otras bacterias existen otros genes (parC y parE) codificantes de otras enzimas, llamadas topoisomerasa IV, pero estos genes no existen en esta bacteria.
Las mutaciones puntuales en QRDR de la ADN-girasa son principalmente: Asn87Lys/Tyr (C261A; C261G); Asp91Gly/Asn/tyr (A272G; G271A; G271G).
Se ha señalado que alguna mutación en el gen gyrB en posición 463 podría ser un nuevo mecanismo de resistencia.
Tetraciclinas
Las tetraciclinas inhiben el crecimiento bacteriano bloqueando la síntesis proteica de la bacteria. Para ello, estos antimicrobianos se unen a la subunidad 30S interaccionando con el ácido ribonucleico ribosómico 16S (16S rRNA). Cuando existen mutaciones en algunos genes del 16S rRNA se bloquea la fijación del aminoacil-tRNA, el ácido ribonucleico de transferencia (tRNA), portador de un aminoácido para ser incorporado a la proteína que se esté sintetizando en el ribosoma.
La mayoría de las cepas aisladas de Helicobacter pylori son sensibles a tetraciclinas con una concentración mínima inhibidora (CMI) menor de 1 mg/L. Sin embargo, la incidencia de resistencias se está incrementando en regiones donde este fármaco se puede obtener sin prescripción médica, por lo que en general la tasa de resistencia a tetraciclinas continua siendo baja (alrededor del 2%). Algunas de las tasas de resistencias encontradas son: América (2,7%), Europa (2,1%), Asia (2,4%), África (43,9%), e Irán (9%).
Las resistencias de alto nivel se producen por sustitución de nucleótidos en el triplete 926-928 (AGA926-928TTC) de los genes rrnA/B del 16S rRNA. Se han encontrado resistencias de bajo nivel por sustitución de uno o dos nucleótidos en ese mismo gen: A926G; A928C; o AG926-927GT. En las cepas aisladas con el triplete AGA926-928 la CMI es de 0,016 a 0,5 mg/L, mientras que si es GGA o AGC la CMI es de 0,75 a 1,5 mg/L.
Rifabutina
La rifabutina es un derivado de la rifamicina S, con una estructura molecular similar a la rifampicina. Este antimicrobiano ejerce su acción inhibiendo a la subunidad beta de la RNAp-DNAd (ARN polimerasa, ADN dependiente), codificada por el gen rpoB. Al inhibir esta enzima, se impide la transcripción del ADN y la formación de ARNm (ARN mensajero).
La tasa media de resistencia es escasa y está en el 1,3%. Cuando se estudia en pacientes no expuestos a este fármaco es menor (0,6%). Sin embargo, cuando se estudia en pacientes que habían recibido tratamientos con rifampicina, la tasa de resistencia es elevada.
Las cepas de Helicobacter pylori resistentes poseen mutaciones en algunos de los siguientes codones: 149, 525 a 545, o 586.
Pruebas realizadas en IVAMI:
- Detección molecular (PCR y secuenciación) de mutaciones de resistencia en cualquiera de los genes implicados en la resistencia a los antimicrobianos utilizados en la terapia de las infecciones por Helicobacter pylori.
Muestra recomendada:
- Cepa aislada en cultivo o biopsia para detectar la presencia de Helicobacter pylori. Si se detecta la presencia de ADN de Helicobacter pylori en la biopsia pueden estudiarse cualquiera de los genes implicado.
Conservación y envío de la muestra:
- Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
- Congelada: más de 2 días.
Coste de la prueba:
- Consultar a ivami@ivami.com