Mycobacterium tuberculosis complex - Cultivo; Diagnóstico molecular (PCR); Pruebas de sensibilidad a fármacos antituberculosos; Mutaciones de resistencia (amplificación y secuenciación de genes rpoB, katG, mabA, embB, pncA, rpsL, rrs, gyrA y tlyA)

 

Información 05-07-18.

 

Las infecciones debidas a especies de género Mycobacterium son un problema creciente en muchos países del mundo. Las especies del género Mycobacterium ha estado en permanente aumento, reconociéndose en la actualidad más de 170 especies, la mayor parte de las cuales no se han relacionado con enfermedad. Sin embargo, este género contiene varias bacterias importantes, que sí causan infecciones y pueden amenazar la vida. Entre las especies patógenas destacan Mycobacterium leprae y las incluidas en el complejo Mycobacterium tuberculosis, que siguen siendo un problema de salud pública.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) para el 2016 reportó 10,4 millones de casos de tuberculosis en el mundo, de los que 1,7 millones fallecieron. Sin embargo, existen muchas otras especies que figuran como oportunistas o como patógenas, que se ha agrupado bajo la denominación de micobacterias atípicas, micobacterias no tuberculosas (MNT) o MOTT (mycobacterium other than tubercle bacilli). Las micobacterias no tuberculosas también son capaces de causar enfermedades graves tanto en individuos inmunocompetentes como inmunocomprometidos. Sin lugar a dudas, las MNT han venido adquiriendo más relevancia en el campo de la salud pública, debido principalmente al incremento de su frecuencia como agentes causales de patologías graves que afectan a pulmones, ganglios linfáticos, piel, heridas, huesos, etc., representando entre el 0,5 y el 30% del total de las enfermedades humanas ocasionadas por micobacterias. Consecuentemente, el interés de la comunidad científica por estos microorganismos ha crecido de forma radical recientemente, lo que ha permitido conocer los diversos aspectos asociados a las patologías que ocasionan y sus factores de virulencia.

La terapia de corta duración recomendada por la Organización de la Salud (OMS), para enfermedades infecciosas causadas por M. tuberculosis, incluye; fármacos de primera línea, más eficaces y menos tóxicos, entre los que se encuentran: Isoniacida, rifampicina, pirazinamida, etambutol y fármacos de segunda línea, para casos de resistencias o intolerancias, entre los que se incluyen estreptomicina, capreomicina, etionamida, cicloserina, PAS, fluoroquinolonas. La terapia para la forma activa sensible a los fármacos antitubderculosos, incluye una combinación estándar de isoniazida, rifampicina, pirazinamida, estreptomicina y etambutol, utilizando la estrategia DOTS (tratamiento con observación directa). Esta estrategia deja de ser la opción terapéutica para pacientes infectados con M. tuberculosis multirresistentes a fármacos antituberculosos, definidas como cepas resistentes al menos a isoniazida y rifampicina. En las últimas dos décadas la tuberculosis con resistencia a fármacos se ha convertido en una amenaza y un reto para la salud pública mundial. El diagnóstico y el tratamiento de estas formas de tuberculosis es mucho más complejo y el pronóstico empeora claramente a medida que se incrementa el patrón de resistencias.

           

Por otro lado, debido a la falta de criterios estandarizados o aceptados para definir enfermedades causadas por MNT, muchos casos con frecuencia se diagnostican erróneamente como tuberculosis y se administran medicamentos antituberculosos, mientras que el tratamiento de las infecciones por MNT no es similar al de MTB. Los nuevos macrólidos (azitromicina y claritromicina) y las quinolonas (ofloxacino y ciprofloxacino) se han convertido en terapia clave para infecciones causadas por MNT.

 

Debido a la crisis de resistencia a los medicamentos, las enfermedades infecciosas causadas por micobacterias clínicamente importantes siguen siendo un importante problema de la salud pública en todo el mundo.

 

Las bacterias pueden presentar resistencia a los antibióticos principalmente por tres mecanismos:

 

Mecanismos de resistencia por alteraciones en la permeabilidad celular

 

La baja permeabilidad de la pared celular micobacteriana, con su estructura inusual, es un factor importante en esta resistencia intrínseca. La envoltura de células micobacterianas consta de tres componentes estructurales principales: una pared de peptidoglicano, el polisacárido de arabinogalactano y los ácidos micólicos de cadena larga. La estructura de la pared otorga propiedades hidrofóbicas que generan baja permeabilidad, lo que se ha asociado a la resistencia intrínseca a procesos de desinfección y a los antimicrobianos. La carga, el tamaño y la hidofobicidad de los antimicrobianos determinan la penetración a través de la membrana celular. Las tasas de penetración de los antibióticos betalactámicos a través de la pared celular externa de M. tuberculosis, es diez veces mayor que en Mycobacterium chelone, y 100 veces menor que en Escherichia coli.

 

M. tuberculosis, es una bacteria fisiológicamente resistente a la mayoría de los antimicrobianos debido fundamentalmente a la estructura lipídica de su pared celular (>60%) que actúa como barrera permeable únicamente a solutos hidrofílicos, aunque éstos atraviesan lentamente la pared celular debido al escaso número de porinas, a la escasa fluidez de los ácidos micólicos y al espesor total de la pared de M. tuberculosis.

 

Mecanismos de resistencia por inactivación enzimática

 

La inactivación enzimática es otro mecanismo descrito en las bacterias para neutralizar la acción de los antimicrobianos. En especies del género Mycobacterium se han encontrado actividades de betalactamasas, metilasas y acetiltransferasas capaces de hidrolizar e inactivar una amplia variedad de antimicrobianos.

 

Mecanismos de resistencia debido a modificaciones de la diana molecular

 

Otro de los factores más importantes relacionados a la resistencia en los esquemas de tratamiento son las modificaciones de la diana molecular. El ribosoma bacteriano es una de las dianas de varios grupos de antimicrobianos, entre los que cabe mencionar a los aminoglicósidos y macrólidos. La acción de estos antibióticos es la inhibición de la síntesis de proteínas a través de su interacción con nucleótidos del ARNr, cerca de sitios que son importantes para su función, como lo son: la región peptidil transferasa del ARNr 23S, donde se unen los macrólidos y la región ARNr 16S, diana para los aminoglicósidos. Los cambios en las dianas de unión generan desde baja hasta alta resistencia a los antimicrobianos. La metilación de las dianas de acción de los macrólidos es otro factor importante, sobre todo en especies como M. abscessus. Éste último mecanismo explica los fallos terapéuticos que se han reportado en pacientes tanto con infecciones pulmonares como en infecciones cutáneas. En el caso de M. tuberculosis, la resistencia a fármacos de primera línea se debe predominantemente a alteraciones en la secuencia de nucleótidos en genes que codifican las dianas de antibióticos.

           

Aunque el concepto de resistencia antimicrobiana básicamente se asocia a una característica fenotípica (incapacidad de crecimiento en presencia de un antimicrobiano), la dificultad técnica que presenta la prueba fenotípica debido la lentitud de crecimiento en cultivo de determinadas bacterias como es el caso de Mycobacterium tuberculosis, ha inducido desde el inicio de los años 90 el desarrollo de técnicas que permiten la detección de los genes o secuencias específicas que codifican la resistencia. Estas técnicas moleculares permiten obtener resultados en cuestión de horas/días, siendo éste un factor crítico para poder establecer lo más pronto posible una pauta terapéutica adecuada. Aunque no puede obviarse el cultivo y las pruebas de susceptibilidad a fármacos, sin embargo dada la lentitud en cultivo de M. tuberculosis hace que el interés por las técnicas moleculares sea cada vez mayor.

 

Estas pruebas moleculares para M. tuberculosis detectan, por técnicas de amplificación genética, mutaciones en los genes que codifican la resistencia a fármacos, son métodos estandarizados y reproducibles. Sin embargo, para otras especies de micobacterias que muestran amplia variabilidad en su sensibilidad a los antimicrobianos, no se ha conseguido la estandarización de los métodos, ni tampoco establecer una correlación clínica clara. No existe un claro consenso en la necesidad de realizar estudios en M. avium complex u otras micobacterias de crecimiento lento. En estos casos, pueden utilizarse métodos como E-test CMI, disco-placa o dilución en caldo.

 

Alteraciones génicas asociadas al desarrollo de resistencia a antimicrobianos de primera y segunda línea para el tratamiento de la tuberculosis

 

Resistencia a isoniazida (INH)

La isoniazida (hidrazida de ácido nicotínico o INH) tiene una potente acción bactericida al interferir con la biosisntesis de los ácidos micólicos de la pared celular de las micobacterias. Es un profármaco que al ser captada por el bacilo, es activada por el sistema catalasa- peroxidasa, de manera que la ausencia de la actividad catalasa, debido a mutaciones en el gen katG, codificante de esta enzima, es uno de los mecanismos de resistencia de INH. Las cepas de M. tuberculosis con mutaciones en el gen katG exhiben poca o ninguna actividad catalasa y son altamente resistentes a INH. Las mutaciones se concentran en una región codificante del gen katG, que comprende los codones 300 al 507, siendo las más frecuentes las sustituciones de la serina 315 por treonina (S315 -->T) y el residuo de arginina 463 por leucina (R463-->L). Estas mutaciones explican aproximadamente el 50% de los casos aislados clínicos resistentes a INH.

 

Por otra parte, la enzima enoil ACP reductasa, involucrada en los pasos de elongación de ácidos grasos, codificada por gen inhA se identificó como una diana de acción de INH. El intermediario de INH, cuya activación depende de la actividad catalasa-peroxidasa intacta, inhibe la actividad de la enzima inhA y en consecuencia la síntesis de ácidos micólicos. Las mutaciones en el gen inhA inducen la sobreexpresión del gen inhA y niveles elevados de la enzima enoil reductasa en cantidades que superan el poder inhibitorio de INH. Las mutaciones en inhA están asociadas a aproximadamente al 25% de los casos de resistencia a INH, generalmente con bajos niveles de resistencia. Las mutaciones en el gen inhA, no solo causan resistencia a la isoniazida, sino que también a la ethionamida. Existen dos genes que participan en esta resistencia ethionamida-isoniazida, designado como mabA e inhA para referirse a la ethionamida e isoniazida, respectivamente. El hecho de que cepas clínicas muestren resistencia tanto a INH como a ETH indica un mecanismo de resistencia cruzado. La investigación de otros genes involucrados en la resistencia a INH que explicasen el mecanismo de resistencia del 10-20% de cepas que carecen de mutaciones en katG o inhA condujo a la identificación del gen ahpC, codificante de la enzima alquil hidroperóxido reductasa, involucrada en la respuesta a estrés oxidativo. Las mutaciones en aphC están asociadas a aproximadamente un 10 a 15% de aislados clínicos resistentes a INH. Actualmente se investigan otros genes candidatos asociados con resistencia a este antimicrobiano.

Resistencia a rifampicina (RIF)

           

El mecanismo de acción de la rifampicina consiste en que el antimicrobiano se une a la ARN polimerasa, la enzima responsable del proceso de transcripción de genes. Al inhibir la expresión de genes, conduce a la muerte de la célula. La resistencia a rifampicina se explica por mutaciones en el gen rpoB, codificante de la subunidad β de la ARN polimerasa. Las alteraciones en esta subunidad impiden que la rifampicina interactúe adecuadamente con la ARN polimerasa e inhiba la transcripción. Se ha demostrado que la resistencia a rifampicina en M. tuberculosis se explica en un 95% a 98% por mutaciones en el gen rpoB, las cuales se localizan generalmente en un corto segmento de aproximadamente 81 pb que incluye los codones 507 a 533 del gen rpoB. Las mutaciones en esta región incluyen deleciones, inserciones, sustituciones, siendo las más frecuentes, las mutaciones en codones para asparagina 516, histidina 526 y serina 531, de manera que los métodos genotípicos para detectar la resistencia a rifampicina se basan en la detección de estas mutaciones. Se han encontrado mutaciones en otras regiones del gen, pero con menor frecuencia.

Resistencia a pirazinamida

La pirazinamida es un compuesto sintético redescubierto en la década de los 80 que ha facilitado el tratamiento antituberculoso de corta duración. Su mecanismo de acción no ha sido bien dilucidado, aunque se ha señalado la importancia de la acción de la enzima pirazinamidasa. Las cepas de micobacterias susceptibles a pirazinamida sintetizan pirazinamidasa, una enzima que transforma la pirazinamida en su metabolito activo, el ácido pirazinoico, el cual además de su actividad específica parece tener la capacidad de disminuir el pH del medio intracelular por debajo de los límites de tolerancia de la bacteria. En cepas de M. tuberculosis con resistencia adquirida y M. bovis con resistencia constitutiva a pirazinamida, se han identificado interrupciones en el gen pncA, codificante de la enzima pirazinamidasa/nicotinamidasa. Uno de los mecanismos de resistencia a pirazinamida propuestos hasta el presente es la deficiencia en pirazinamidasa, con la subsecuente pérdida de la capacidad de activar el antimicrobiano.

Resistencia a los aminoglucósidos (estreptomicina, kanamicina, amikacina)

La estreptomicina es un antibiótico aminoglucósido bactericida que actúa sobre los ribosomas inhibiendo la síntesis de proteínas a través de la unión a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano, lo que causa una mala interpretación del mensaje del ARNm durante la traducción. El sitio de acción de la estreptomicina es la subunidad 30S del ribosoma en la proteína ribosomal S12 y el ARNr 16S.

En la mayoría de cepas de M. tuberculosis resistentes a estreptomicina se han encontrado mutaciones en el gen rpsl que codifica la proteína ribosomal S12. Otra mutación identificada, pero de menor frecuencia se localiza en el gen rrs que codifica el ARN ribosomal 16S en una región que interactúa con la proteína S12. Las mutaciones en los genes rpsL y rrs son el principal mecanismo de resistencia a la estreptomicina que totalizan aproximadamente 50% y 20%, respectivamente, de las cepas resistentes.

La kanamicina y su derivado, la amikacina, son también inhibidores de la síntesis de proteínas a través de la modificación de las estructuras ribosomales en el ARNr 16S. Las mutaciones en la posición 1400 del ARNr 16S (rrs) se asocian con un alto nivel de resistencia a ambos antimicrobianos. Se demostró que un gen denominado tlyA que codifica la metiltransferasa del ARNr está involucrado en la resistencia a la capreomicina en cepas de M. tuberculosis.

Resistencia a etambutol

El etambutol es un compuesto sintético que actúa como bacteriostático, cuyo mecanismo de acción es inhibir la síntesis de componentes de la pared micobacteriana a las dosis habituales. Las alteraciones génicas identificadas hasta ahora se concentran en una región designada como embCAB, que incluye genes codificantes para arabinosiltransferasas, enzimas que participan en la síntesis de componentes únicos de la pared celular de micobacterias. Las mutaciones en la región emb se asocian a altos niveles de resistencia y se han identificado en aproximadamente el 65% de los aislados clínicos resistentes a etambutol.

Resistencia a fluoroquinolonas

Las topoisomerasas del ADN son un conjunto diversos enzimas esenciales responsables de mantener los cromosomas en un estado topológico adecuado. Estos fármacos inhiben la acción de las topoisomerasas que se encargan del superenrrollamiento del ADN para facilitar su ubicación dentro de la bacteria, así como del desenrrollamiento para facilitar su replicación y transcripción, actuando principalmente sobre las enzimas ADN-girasas, codificadas principalmente por el gen gyrA. La resistencia a las quinolonas en el curso de tratamiento aparece con frecuencia y se asocia a mutaciones puntuales en el gen gyrA. Se consideran fármacos de segunda línea en el tratamiento antituberculoso, aunque el incremento de la resistencia a los fármacos de primera línea ha aumentado su uso en el caso de cepas resistentes.           

Resistencia a etionamida / protionamida y tioamidas 

La etionamida (2-etilisonicotinamida) es un derivado del ácido isonicotínico y es bactericida sólo contra M. tuberculosis, M. avium-intracellulare y M. leprae. Al igual que la isoniazida, la etionamida es también un profármaco que es activado por la EtaA / EthA (una monooxigenasa) e inhibe el mismo objetivo que la isoniazida, la InhA de la ruta de síntesis de los ácidos micólicos.

La protionamida (PTH, 2-etil-4-piridinacarbotioamida) tiene una estructura y actividad casi idéntica a las de la etionamida. La EtaA o EthA es un flavín adenín dinucleótido (FAD) que contiene la enzima que oxida la etionamida hasta el óxido de azufre correspondiente, que posteriormente se oxida a 2-etil-4-amidopiridina, presumiblemente vía el intermediario de ácido sulfónico oxidado inestable. La EtaA activa también la tioacetazona, tiocarlida, tiobenzamida y, tal vez, otros medicamentos pertenecientes a las tioamidas, lo que explica la resistencia cruzada entre la etionamida y la tioacetazona, tiocarlida y otras tioamidas y tioureas. Las mutaciones en la enzima EtaA / EthA activadora del antimicrobiano causan resistencia a la etionamida y a otras tioamidas. Además, las mutaciones en la diana InhA confieren resistencia tanto a la etionamida como a la isoniazida.

Pruebas realizadas en IVAMI:

  • Detección molecular (PCR) para los genes que determinan resistencias (rpoB, katG, mabA, embB, pncA, rpsL, rrs, gyrA, tlyA ) y posterior secuenciación del amplificado.
  • Cultivo y pruebas se sensibilidad a fármacos de primera línea en equipo MGIT 960.

 

Muestra recomendada: 

  • Muestras respiratorios (esputo, broncoaspirado, lavado broncoalveolar, jugo gástrico), líquidos estériles (LCR, articular, peritoneal, pleural, pericárdico, etc.), tejidos (biopsias) y orina (aconsejable recoger tres muestras (mínimo de 40 ml) durante tres días consecutivos).
  • Aislado de M. tuberculosis.

 

Conservación y envío de la muestra:

  • Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
  • Las biopsias parafinadas pueden conservarse y enviarse a temperatura ambiente o en refrigeración.
  • Las biopsias frescas deben conservarse preferiblemente congeladas.

 

Plazo de entrega de resultados: 

  • Detección molecular (PCR) para los genes que determinan resistencias y posterior secuenciación: 3-5 días.

 

Coste de la prueba:  

  • Detección molecular (PCR) para los genes que determinan resistencias y posterior secuenciación: consultar a ivami@ivami.com.