Coronavirus SARS-CoV-2 (Coronavirus de COVID-19) -  Anticuerpos neutralizantes protectores, específicos frente a SARS-CoV-2 (COVID-19): anticuerpos neutralizantes por microneutralización.

 

Información 23-01-2021.

 

SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) es un virus con genoma de ARN (+ssRNA) perteneciente al género Beta-Coronavirus (familia Coronaviridae). El genoma de SARS-CoV-2 codifica cuatro proteínas principales: S-spike (espícula); E-envelope (envoltura); M-Membrane (Membrana); y NP-Nucleoproteína (Nucleocapside). Además, codifica unas 16 proteínas no estructurales (nsp 1-16), y 5 a 8 proteínas accesorias.

La proteína S (spike/espícula), tiene un papel esencial en la fijación del virus a la célula que va a infectar, en la fusión de la membrana de la envoltura viral con la membrana de la célula que vaya a infectar y en la penetración dentro de ella. Por esta razón en muy importante en todo el proceso de transmisión del virus. Esta proteína es homotrimérica, es decir, está integrada por tres polipéptidos iguales. En cada uno de ellos existe una subunidad S1 que corresponde a la porción N-terminal de la proteína, y una subunidad S2 que es la responsable de la fusión de ambas membranas (envoltura viral y de la célula a infectar). La subunidad S1 se puede dividir en el dominio (región) N-terminal (NTD) y un dominio (región) de unión al receptor denominado RBD (Receptor Binding Domain). Tanto en SARS-CoV, como SARS-CoV-2, el dominio RBD se fija al receptor ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2) que se encuentra en los neumocitos y enterocitos, mientras que MERS-CoV se fija al receptor de Dipeptidyl-peptidase 4 (DPP4) que se encuentra en hígado y pulmón.

El dominio (región) RBD es una glicoproteína homotrimérica (tres copias de la proteína de la espícula viral, proteína S) que interacciona con el receptor ACE2. Al unirse con el receptor ACE2 desencadena una cascada de fusión que conduce a la penetración del virus dentro de la célula para que pueda comenzar la replicación viral.

Si se altera la interacción entre RBD y ACE2 se bloquea la penetración celular del virus. Para poder bloquear esa interacción, se requieren anticuerpos anti–RBD que se unan a RBD y de esa forma no pueda interaccionar con el receptor celular ACE2.

En modelos animales se ha podido evidenciar que los anticuerpos neutralizantes (NAbs: Neutralizing Antibodies) frente a SARS-CoV-2 protegen frente a la infección en modelos animales y se evalúan para ser utilizados en la profilaxis y terapéutica en humanos. En estudios experimentales utilizando hámsteres se ha demostrado que los anticuerpos neutralizantes frente a dos epítopos (secuencia de aminoácidos) del dominio de fijación RBD protegen frente a la exposición a altas concentraciones de SARS-CoV-2.

En humanos se ha demostrado que la mayoría de los individuos con infección leve o moderada por SARS-CoV-2, desarrollan una respuesta de anticuerpos IgG potente frente a la proteína de la espícula viral. La cuantía (título) de estos anticuerpos detectados por métodos inmunoenzimáticos (ELISA) es relativamente estable durante un periodo de al menos 5 meses y los títulos de anticuerpos detectados frente a la proteína de la espícula se correlacionan con los títulos de anticuerpos encontrados por neutralización. El 90% de los individuos con seroconversión, es decir que pasan de no tener anticuerpos a tenerlos, tienen una respuesta de anticuerpos que incluyen anticuerpos neutralizantes. También está demostrado que los casos de infecciones graves por SARS-CoV-2 tienen respuesta de anticuerpos.

Sin embargo, es importante conocer la respuesta en los casos de infección leve y en los de infección asintomática, porque corresponden a la mayoría de las infecciones. En ellos se requiere conocer la duración y funcionabilidad (neutralización en su caso) de la respuesta de anticuerpos.

Los anticuerpos frente a SARS-CoV-2 pueden ser frente a antígenos estructurales y no estructurales. En las pruebas serológicas se utilizan dos tipos de antígenos: una proteína NP (nucleoproteína) que es abundante y que se encuentra dentro del virus o dentro de la célula infectada donde el virus se replica. Por la función biológica de la nucleoproteína (NP) y porque está protegida de los anticuerpos por la membrana viral del virus o por la membrana células en el caso de la célula infectada, es poco probable que los anticuerpos frente a la nucleoproteína puedan neutralizar o bloquear la penetración celular de SARS-CoV-2. La segunda proteína que suele utilizarse como diana para detectar anticuerpos es la proteína de la espícula (S).

Pruebas rápidas para anticuerpos IgM y/o IgG

Las pruebas rápidas de detección de anticuerpos que permiten disponer de resultados en un tiempo máximo de unos 15 minutos, denominadas inmunoensayos de membrana cualitativos (Qualitative Membrane Based Immunoassays), pruebas inmunocromatográficas de fase sólida (Solid Phase Immunochromatographic test), pruebas de flujo lateral (Lateral Flow test) o simplemente pruebas rápidas de IgM/IgG, están basadas en el siguiente procedimiento:

Un dispositivo que contiene una membrana en la que se encuentran dispuestos a lo largo de dos líneas unos anticuerpos anti-IgM y anti-IgG, respectivamente para fijar los anticuerpos humanos de clase IgM o IgG que puedan encontrarse en muestras como plasma, suero o sangre total. Estos anticuerpos de clase IgM o IgG los poseen todas las personas, pero con diferentes tipos de especificidad para reaccionar con determinados antígenos. Para conocer si son específicos para reaccionar con los antígenos de Coronavirus SARS-CoV-2 (Causante de COVID-19), es necesario utilizar un antígeno propio de este Coronavirus. En esto se pueden diferenciar las distintas pruebas (kits) disponibles. La mayoría de las pruebas no indican qué tipo de antígenos de este virus incluyen. Estos antígenos, suelen ser recombinantes, y pueden corresponder a la nucleoproteína del virus (NP), la espícula (S) o alguna región concreta de la espícula. Para revelar si el antígeno empleado se ha fijado por los anticuerpos previamente fijados a los sistemas de detección de la membrana, los antígenos utilizados están ligados a partículas de oro coloidal, formando un conjugado llamado “conjugado antígeno-oro coloidal”. Si los anticuerpos propios de la persona estaban fijados a la membrana y son específicos de antígenos de este Coronavirus, fijarán este complejo y aparecerá una banda coloreada en la membrana.

Es importante conocer qué tipo de proteínas se utiliza en las pruebas rápidas (kits) de detección de anticuerpos IgM y/o IgG, ya que si estas pruebas, poseen antígeno de nucleoproteína (NP) no se puede establecer o predecir una correlación con la existencia de anticuerpos neutralizantes. Por el contrario, si las pruebas rápidas poseen antígeno de la región S1 de la glicoproteína de la espícula se puede concluir que en el 90 % de los casos, cuando son positivas, pueden detectar anticuerpos que funcionalmente podrían ser neutralizantes.

Anticuerpos neutralizantes mediante microneutralización

En las pruebas de anticuerpos neutralizantes mediante microneutralización, se utiliza una cepa de SARS-CoV-2 aislada en cultivo celular en nuestro laboratorio a partir de muestra de paciente, que se replicado en nuestro laboratorio mediante pases en cultivos celulares de células Vero E6 y se ha cuantificado para poder utilizar una concentración determinada de virus en las pruebas. Estos virus son enfrentados durante un tiempo establecido con el suero o plasma de individuos infectados o vacunados, para que en caso de que posean anticuerpos neutralizantes, se unan a las proteínas de la espícula. Finalmente, para demostrar si se han unido y bloqueado la espícula, la mezcla de virus y suero o plasma, se inocula en cultivos celulares susceptibles para conocer si el virus estaba activo o bloqueado, según los efectos producidos en los cultivos celulares. La prueba se realiza con diferentes diluciones (concentraciones) de suero o plasma para poder determinar la cantidad (título) de anticuerpos neutralizantes que pueda poseer la persona evaluada.

Pruebas realizadas en IVAMI:

 

  • Prueba de anticuerpos neutralizantes mediante microneutralización viral utilizando cepa de SARS-CoV-2 aislada en Valencia y suero o plasma sanguíneo de la persona infectada o vacunada.

Muestra recomendada:

 

  • Suero o plasma sanguíneo de la persona analizada (mínimo 1 mL) separado en tubo estéril.

 

Conservación y envío de la muestra:

 

  • Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días. Más tiempo, congelado.