Agentes contaminantes en medicamentos de terapia avanzada:
Agentes adventicios bovinos y porcinos; Virus adventicios; Retrovirus; Detección de agentes retrovirales: Virus murinos anfotrópicos, xenotrópicos y ecotrópicos.
(Disposiciones NFC-AEMPS [Norma de Fabricación Correcta de AEMPS]; Directiva 2003/94/CE; Real Decreto 824/2010, de 25 de junio; FDA-PTC [Points-to-Consider] for Monoclonal Antibodies; FDA [ICH Guideline Q5A(R2)]-Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin Guidance for Industry; EMEA/CPMP/BWP/268/95; EMEA/CHMP/BWP/398498/2005; EMA/CHMP/ICH/24235/2006-ICH Guideline Q9 on quality risk management).
Los agentes adventicios, son aquellos agentes biológicos (bacterias, hongos, parásitos, micoplasma, virus o incluso priones), que no se introducen intencionadamente y que contaminan los cultivos celulares. Aunque pueden pertenecer a cualquiera de los grupos biológicos indicados, el principal problema de interés son los virus, por sus requerimientos específicos para ser detectados.
Los virus adventicios pueden ser difíciles de detectar, ya que los métodos convencionales para su detección requieren observar los efectos citopáticos generados en los cultivos celulares, o bien demostrar el efecto hemaglutinante en los sobrenadantes del cultivo celular para eritrocitos de alguna/s especie/s (medio de cultivo líquido que ha estado con los cultivos celulares), o bien la capacidad hemadsorbente (adherencia de eritrocitos de alguna/s especie/s a los cultivos celulares desarrollados en monocapas). Estos virus pueden provenir de las propias células al estar en ellas en los animales infectados, usar un virus para establecer una línea celular, o bien introducirse accidentalmente durante la manipulación de los cultivos celulares o por estar presentes en algunos reactivos biológicos contaminados (p.ej. suero bovino fetal agregado a la solución de medio de cultivo como fuente de proteínas o tripsina porcina). Su presencia debe ser analizada para realizar un control adecuado que evite la contaminación por ellos al ser administrado el preparado de origen biológico como medicamento.
Los principales productos biológicos en los que se debe descartar la presencia de virus adventicios son los siguientes: Anticuerpos monoclonales; Líneas celulares (master cell bank -MCB-); Células de trabajo en uso (working cell bank -WCB-); Sobrenadantes de cultivos celulares; Productos biológicos obtenidos sin procesar (Unprocessed bulk); o Medicamentos biológicos finalizados.
Para detectar los virus adventicios se pueden utilizarse varios tipos de procedimientos: 1) Infectividad in vitro de cultivos celulares; 2) Amplificación de ácidos nucleicos (PCR, RT-PCR o secuenciación masiva -NGS-); 3) Generación de anticuerpos específicos en roedores (ratón, rata, hámster); 4) Pruebas de inoculaciones in vivo.
- Los métodos de infectividad in vitro en cultivos celulares permiten detectar muchos virus, pero tienen el inconveniente de que debe utilizarse la línea celular adecuada según el tipo de virus que se desea detectar, y para evidenciar su presencia se debe seguir el método correcto (a.-visualización de efecto citopático, si es que se produce; b.-la generación de antígenos expresados y liberados al medio de cultivo celular mediante aglutinación de eritrocitos -hemaglutinación-, o en la superficie celular de los cultivos en monocapas durante su replicación que puedan detectarse por adherencia a la superficie de la monocapa celular -hemadsorción-). Uno de los problemas es que los cultivos celulares deben mantenerse durante un tiempo adecuado, hasta 28 días, con pases intermedios a los 7 o 14 días, con los consiguientes cambios periódicos de medios de cultivos, etc. Las células utilizadas deben incluir al menos una línea celular de cada especie de origen, como una línea celular diploide humana (p.ej. MRC-5) y una línea celular de riñón de mono (p.ej. células Vero). Se pueden utilizar métodos moleculares como alternativa.
- Los métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos del virus (ARN o ADN), requieren utilizar cebadores (primers) específicos del virus a detectar, ya que las familias, y a veces los géneros de una familia, son filogenéticamente diferentes y no comparten una secuencia genómica común que permitan amplificarse con una sola pareja de cebadores, como ocurre con las bacterias con la amplificación del gen de 16S rARN, o con los hongos con la amplificación del gen de 28S rRNA. Ello implica realizar muchos procedimientos diferentes, según los virus cuya presencia se desea determinar.
- Los métodos basados en la generación de anticuerpos específicos inocular el producto a roedores y detectar posteriormente los anticuerpos específicos generados. Pueden realizarse en ratones (Prueba de producción de anticuerpos de ratón -Mouse Antibody Production -MAP-) cuando se utilizan líneas celulares murinas; producción de anticuerpos en hámster (Hamster Antibody Production -HAP-); o en ratas (Rat Antibody Production -RAP-). Estos métodos pueden actualmente sustituirse por pruebas moleculares.
- Los métodos de inoculaciones in vivo pueden realizarse con ratones lactantes, ratones adultos o huevos de gallina embrionados. Estos métodos requieren realizar el seguimiento del estado de los animales o en el caso de los huevos de gallina embrionados, detectar la presencia de virus hemaglutinantes. Estos métodos pueden actualmente sustituirse por pruebas moleculares.
Virus adventicios para los que se considera recomendada su detección:
Cuando se utilizan líneas celulares de primates no-humanos deben examinarse para Herpesvirus de simios, Citomegalovirus de simios (sCMV), virus de inmunodeficiencia de simios, virus linfotrópico de células T de simios (STLV), virus linfotrópico de células T humano (HTLV), virus Foamy de simios, virus de inmunodeficiencia humana (HIV), virus de encefalomiocarditis, virus de fiebre hemorrágica de simios (SHF), virus Varicella de simios (sVZV), Adenovirus, SV40, Monkeypox, Rubeola, virus Ebola, Retrovirus de simios (SRV), o cualquier otro virus zoonótico.
Cuando se utilizan líneas celulares de origen humano deben examinarse para virus de Epstein-Barr (EBV), Citomegalovirus (CMV), Hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV), virus Herpes humano tipo 6 (HHV-6), virus de la Coriomeningitis linfocitaria (LCM), virus linfotrópico de células T (HTLV), virus Foamy humano, y cualquier otro virus posible según la historia del donante del que procede la línea celular. No deben utilizarse células procedentes de pacientes con enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) o TSE (Transmissible Spongiform Encephalopathies), ni de sus familiares.
Para las líneas celulares con exposición a materias primas de origen humano o animal (por ejemplo, suero bovino, tripsina porcina), se deben realizar pruebas para virus humanos, bovinos y porcinos. De acuerdo con el documento 9 CFR, parte 113.47, los virus bovinos a analizar deben ser al menos: Virus de la diarrea viral bovina, Reovirus, virus de la rabia, virus de la lengua azul, adenovirus bovino, parvovirus bovino, y virus respiratorio sincitial bovino; mientras que los virus porcinos deben ser al menos: Virus de la diarrea viral bovina, Reovirus, virus de la rabia, adenovirus porcino, parvovirus porcino, virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV), virus de la encefalitis hemaglutinante porcina (PHEV). El cliente puede solicitar la detección de virus adicionales.
Cuando se utilizan células para producción de anticuerpos monoclonales deben analizarse para virus Sendai, virus Hantaan, virus de Corimeningitis linfocitaria, Parvovirus diminuto de ratón (Minute virus of mice -MVM-), entre otros.
En cualquier línea celular o en los productos generados debe analizarse para excluir presencia de retrovirus. Muchas líneas celulares, como por ejemplo las células murinas usadas para producir anticuerpos monoclonales pueden estar infectadas con retrovirus murino. Los retrovirus pueden detectarse mediante microscopía electrónica, mediante co-cultivo con células susceptibles a retrovirus, o por la presencia de transcriptasa reversa con su variante de ensayo PERT (product-Enhanced Reverse Transcriptase). En IVAMI se realiza la detección de actividad retrotranscriptasa mediante RT-PCR del gen codificante de la poliproteína del virus del mosaico del tabaco (BMV). Se puede solicitar la detección de agentes retrovirales adicionales, como agentes retrovirales murinos anfotrópicos, xenotrópicos, ecotrópicos… etc.
Relación de pruebas
- Detección de agentes adventicios bovinos (cultivos celulares) (cultivos de líneas celulares MDBK; BT; u otras requeridas)
- Detección de agentes adventicios bovinos (PCR para los virus con genoma ADN: Adenovirus bovino; Herpesvirus bovino; Parvovirus bovino; Papilomavirus bovino; Polyoma bovino, u otros requeridos).
- Detección de agentes adventicios bovinos (PCR para los virus con genoma ARN: Virus de la rabia, virus de la diarrea viral bovina, Virus de la lengua azul, Coronavirus bovino; Enterovirus bovino; Parainfluenza bovino; Reovirus bovino; Respiratorio sincitial bovino; Rhinovirus bovino; Rotavirus bovino.
- Detección de agentes adventicios porcinos (cultivos celulares) (cultivos de líneas celulares ST, y PK-15, u otras reequeridas)-Pruebas con cada una de las líneas celulares durante 28 días de cultivo.
- Detección de agentes adventicios porcinos (PCR para los virus con genoma ADN: Adenovirus porcino; Herpesvirus porcinos tipo 1, 2 y 3; Circovirus porcino tipos 1 y 2; Citomegalovirus porcino » Herpesvirus porcino tipo 2; Parvovirus porcino; u otros requeridos).
- Detección de agentes adventicios porcino (PCR para los virus con genoma ARN: Coronavirus porcinos (TGEV y PHEV); Rotavirus porcino A, B y C; Sapelovirus porcino (PEV-8); u otros requeridos.
- Detección de agentes adventicios humanos (PCR para los virus con genoma ADN: Virus de Epstein-Barr (EBV); Citomegalovirus (CMV); virus Herpes humano 6 (HHV-6); u otros requeridos.
- Detección de agentes adventicios humanos (PCR para los virus con genoma ARN: virus linfotrópico de células T (HTLV); virus de hepatitis B (HBV); virus de hepatitis C (HCV); virus de la Coriomeningitis linfocitaria; u otros requeridos.
- Detección de agentes adventicios de primates no-humanos (simios) (PCR para los virus con genoma ADN: Herpesvirus de simios; Citomegalovirus de simios (sCMV); virus Varicella de simios (sVZV); Adenovirus; Monkeypox; Polyomavirus Simian virus 40 (SV40); u otros requeridos.
- Detección de agentes adventicios de primates no humanos (simios) (PCR para los virus con genoma ARN: virus de Inmunodeficiencia de simios; virus Linfotrópico de células T de simios (STLV); virus Foamy humano (HFV-Human Foamy virus); virus de encefalomiocarditis; virus de fiebre hemorrágica de simios (SHF); Rubeola; virus Ebola; Rotavirus de simios; virus Foamy de simios (SFV-Simian Foamy virus); u otros requeridos).
- Ensayo in vitro de virus adventicios (por PTC: Points to Consider).
- Ensayo in vitro de contaminantes virales (FDA: Q5A(R2). Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin Guidance for Industry).
- Detección de agentes retrovirales (detección de retrotranscriptasa inversa en muestras de cultivos celulares con BMV [Brome Mosaic Virus] por RT-PCR).
- Detección de agentes retrovirales (virus murinos anfotrópicos-Murine Leukemia virus-MuLV-A) (RT-PCR).
- Detección de agentes retrovirales (virus murinos xenotrópicos-MuLV-X) (RT-PCR).
- Detección de agentes retrovirales (Virus murinos ecotrópicos-Murine C-type retrovirus-MuLV-E) (RT-PCR).
- Prueba de producción de anticuerpos de ratón (MAP: Mouse Antibodies Production). No realizado en nuestro laboratorio.