Bacterias nitrificantes (bacterias oxidantes de amonio –AOB-, y bacterias oxidantes de nitritos –NOB-): Cuantificación por PCR en tiempo real. 

 

Las bacterias nitrificantes son bacterias quimioautotróficas (sintetizan por sí solas todos los componentes químicos de sus estructuras a partir de elementos químicos simples), o quimiolitotróficas (sintetizan todos componentes químicos de sus estructuras a partir de compuestos inorgánicos, y obtienen la energía durante este proceso). Estas bacterias son muy abundantes en la naturaleza, encontrándose en el suelo, en los lagos y en las corrientes de los ríos con elevado contenido en aguas residuales. Su importancia radica en que participan en el ciclo del nitrógeno en la naturaleza.

El nitrógeno puede encontrarse libre en la atmósfera (N2), o formando parte de la materia orgánica, tanto en los aminoácidos (grupos amino –NH2-) como en los ácidos nucleicos (ADN y ARN) (nucleótidos con bases púricas y pirimidínicas nitrogenadas). Es uno de los elementos indispensables de la materia orgánica, y si no existiese nitrógeno, no existiría vida.

El nitrógeno puede llegar al suelo a través del amoniaco (NH3) procedente de la materia orgánica de los seres vivos (excrementos, detritus vegetales, cadáveres de animales, ...,). También puede existir nitrógeno en el suelo cuando existan bacterias capaces de fijar el nitrógeno atmosférico (N2),  transformándolo en amonio (NH4+). Existen varias especies de bacterias capaces de fijar nitrógeno, algunas de ellas asociadas a las raíces de las plantas leguminosas (guisantes, ....) como son los Rhizobium spp., y otras que se encuentran libres como ocurre con Azotobacter spp., Beijernickia spp. Clostridium spp., Cyanobacteria spp., etc. El proceso por el cual las bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico incorporan el nitrógeno al suelo en forma de amoniaco se denomina Amonificación. Una de las bacterias más importantes en este proceso es Azotobacter spp.

El amoniaco que se encuentra en el suelo puede oxidarse y convertirse en nitritos y éstos a su vez, posteriormente convertirse en nitratos. El proceso de conversión del amoniaco en nitritos y en nitratos se denomina nitrificación. La nitrificación es un proceso que se realiza en dos etapas. En la primera el amonio (NH4+) se oxida a nitritos por parte de las bacterias oxidantes de amonio (AOB: Ammonium oxidazing bacteria) y en la segunda, los nitritos son oxidados a nitratos por las bacterias oxidantes de nitritos (NOB: Nitrite oxidazing bacteria). Posteriormente, los nitratos pueden convertirse de nuevo en nitrógeno libre por parte de las bacterias desnitrificantes, proceso denominado desnitrificación. Entre las bacterias desnitrificantes se encuentran muchas bacterias gramnegativas anaerobias facultativas: Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Bacillus licheniformis, Paracoccus spp., e incluso una de las bacterias nitrificantes, Nitrosococcus spp. ya que esta bacteria participa tanto en la nitrificación como en la desnitrificación. De esta forma el nitrógeno vuelve a la atmósfera completando el ciclo.

El proceso de la nitrificación es realizado por dos grupos de bacterias quimiolitotróficas (bacterias que obtienen la energía utilizando compuestos químicos inorgánicos), no relacionadas filogenéticamente.

Las bacterias nitrificantes se incluyeron inicialmente en la familia Nitrobacteraceae. Cuando se secuenció su ácido ribonucleico ribosómico (16S rRNA), la familia se subdividió ya que se encontró que incluía bacterias genéticamente muy diversas. Actualmente las bacterias nitrificantes se han clasificado en los siguientes géneros:

Formación de nitritos a partir de amonio (nitrificación - primera etapa) realizada por bacterias oxidantes de amonio, que poseen amonio-mono-oxigenasa (AMO) e hidroxilamina-oxido-reductasa (HAO: hidroxilamine oxidoreductase):

      • Nitrosomonas spp. (Clase betaproteobacterias).
      • Nitrosospira spp. (Clase betaproteobacterias).
      • Nitrosococcus spp. (Clase gammaproteobacterias).

Transformación de nitritos en nitratos (nitrificación - segunda etapa), realizada por bacterias oxidantes de nitritos, que poseen nitrito-oxido-reductasa (NXR):

      • Nitrobacter spp. (Clase alfaproteobacterias).
      • Nitrospira spp. (Clase deltaproteobacterias).
      • Nitrococcus spp. (Clase gammaproteobacterias).

Las características microbiológicas de las principales bacterias nitrificantes son las siguientes:

      • Nitrosomonas spp. (N. europea): bacilos gramnegativos cortos o largos, móviles o inmóviles, que se encuentran en el suelo (tierra), aguas residuales, aguas dulces o aguas marinas.
      • Nitrosospira spp.: bacterias espirales, móviles por flagelos peritricos, que se encuentran en el suelo (tierra).
      • Nitrosococcus spp. (N. oceani; N. halophilus; N. nitrosus; N. vatsoni): bacterias gramnegativas, esféricas o elipsoidales, en parejas o tétradas, móviles, que se encuentran en aguas dulces o marinas. Estas bacterias además de participar en el ciclo del nitrógeno, también participan en el ciclo del azufre, reduciendo los sulfatos a SH2. Además tienen actividad desnitrificante liberando nitrógeno a la atmósfera a partir de los nitratos.
      • Nitrobacter spp. Bacilos cortos, móviles o inmóviles, grannegativos. Habitan en el suelo (tierra), aguas dulces o aguas marinas.
      • Nitrospira spp. (N. gracilis; N. marina). Bacterias helicoidales o en forma de vibrio (coma). Se encuentran en el suelo (tierra) y en aguas marinas.
      • Nitrococcus spp. (N. mobilis). Cocos aerobios gramnegativos móviles, halófilo obligado, presente solamente en aguas marinas ya que es un halófilo obligado. Es más sensible a la luz que Nitrobacter spp. y por ello no vive próxima a la superficie marina, ni tampoco muy profunda porque requiere oxígeno. Esta bacteria es muy importante en el ciclo del nitrógeno en ambientes marinos. También participan en el ciclo del carbono marino fijando carbono que luego es utilizado por las bacterias heterótrofas.

La oxidación de amonio es un proceso complejo que requiere dos enzimas: amonio-mono-oxigenasa (AMO) e hidroxilamina-oxidoreductasa (HAO), ya que inicialmente el amonio se convierte en hidroxilamina (NH2OH) (catalizado por la amonio-mono-oxigenasa), y posteriormenmte, ésta se convierte en nitritos (HNO2) (catalizado por la hidroxilamina-oxidoreductasa).

      • NH3  + 1½ O2 → HNO2 + H2O (formación de nitritos: amonio-mono-oxigenasa e hidroxilamina-oxidorreductasa)
      • HNO2 + H2O → HNO3 (formación de nitratos: nitritooxidorreductasa)

Posteriormente, otras bacterias como Nitrobacter spp. oxidan los nitritos a nitratos utilizando el oxígeno como aceptor final de electrones. De esta forma el producto final de las bacterias que participan en la primera etapa, como es Nitrosomonas spp., es el sustrato energético de las bacterias de la segunda etapa, como es Nitrobacter spp. Por esta razón, ambos grupos de bacteria se encuentran generalmente asociadas en la naturaleza.

Para su desarrollo es perjudicial la luz, por lo cual en la naturaleza se cubren de una biocapa, y en el laboratorio los cultivos deben protegerse de la luz.

En los abonos, por ejemplo, deben existir abundantes Azotobacter spp. para fijar nitrógeno atmosférico (amonificación), y debe existir la menor cantidad posible bacterias nitrificantes oxidantes de amonio (AOB) para evitar que transformen el amonio en nitritos, y este a su vez sea convertido por las bacterias oxidantes de nitritos (NOB) en nitratos.

En agricultura, las bacterias que realizan la primera etapa de la nitrificación, como es  Nitrosomonas spp., son un problema porque convierten el amonio, utilizado como fertilizante, en nitritos, y éste no puede ser utilizado por las plantas igual que el amonio. También los nitritos pueden contaminar las aguas subterráneas siendo perjudicial para el consumo.

Estas bacterias también pueden vivir en las paredes de edificios y otras superficies (por ejemplo, monumentos) de áreas polucionadas en las que la atmósfera contiene abundante cantidad de compuestos nitrogenados. Al utilizar el amonio producen ácido nítrico, y este ácido disuelve algunas piedras y otros materiales de construcción de estatuas y edificios. Puede llegar a penetrar incluso 15 cm en profundidad en las piedras arenosas.

Estas bacterias tienen una tasa baja de crecimiento, son sensibles a muchos factores ambientales, como la concentración de amonio, la concentración de oxígeno, la intensidad de la luz, los nutrientes, pH, salinidad, cambios de temperatura, y son incapaces de competir con las bacterias heterotróficas (bacterias que obtienen la energía metabolizando compuestos orgánicos). Las dificultades para poder cultivar in vitro estas bacterias, ha limitado su cuantificación a los métodos como el número más probable (NMP). Por esta razón, los métodos de cuantificación basados en PCR han encontrado sus aplicaciones en esta área.

El desarrollo de métodos moleculares para detectar los genes del 16S rRNA (ácido ribonucleico ribosómico 16S) y el gen amoA (enzima oxidante de amonio), ha permitido estudiar las poblaciones de bacterias oxidantes de amonio en varios tipos de condiciones ambientales. Se han aplicado diferentes métodos moleculares como: fluorescencia in situ que utiliza sondas fluorescentes (FISH), amplificación con PCR específicas, métodos de PCR cuantitativas como la PCR de dilución límite, PCR cinética, PCR competitiva, y PCR en tiempo real (Real-time PCR).

Pruebas realizadas en IVAMI

  • Cuantificación de todas las bacterias nitrificantes (oxidantes de amonio -AOB- y oxidantes de nitritos -NOB-), presentes en una muestra por unidad de peso o volumen, mediante PCR en tiempo real. 

Volumen/peso de muestra

  • El volumen/peso de la muestra requerido es de 25 mL o g.

Plazo de entrega de resultados       

  • Aproximadamente de unos 10 días a partir de la recepción de la muestra en nuestro laboratorio. Si disponemos antes de los resultados se lo comunicaríamos.

Coste de las pruebas

  • Cuantificación de las bacterias oxidantes de amonio (AOB) (primera etapa de la nitrificación), mediante PCR en tiempo real.
  • Cuantificación de las bacterias oxidantes de nitritos (NOB) (seguna etapa de la nitrificación) mediante PCR en tiempo real.
  • Cuantificación de las bactetias oxidantes de amonio (AOB) (primera etapa de la nitrificación) y de las bacterias oxidantes de nitritos (NOB) (segunda etapa de la nitrificación), simultáneamente, mediante PCR en tiempo real.
  • Detección cualitativa de bacterias oxidantes de amonio mediante PCR cualitativa en tiempo real.
  • Detección cualitativa de Nitrosomonas europaea cluster mediante PCR en tiempo real.
  • Detección cualitativa de Nitrosomonas nitrosa cluster mediante PCR en tiempo real.
  • Detección cualitativa de Nitrosomonas cryotolerans cluster mediante PCR en tiempo real.
  • Detección cualitativa de Nitrosococcus mobilis mediante PCR en tiempo real.
  • Detección cualitativa de Nitrosospira spp. mediante PCR en tiempo real.
  • Consultar a ivami@ivami.com.