Phythophthora ramorum – Detección molecular por PCR 

Información (20-05-15)

Phytophthora ramorum fue descrita inicialmente como un nuevo patógeno en Rhododendron spp, y Viburnum bodnantense en Europa (2001), en Holanda y Alemania (1993), y no se consideró muy dañino, hasta que se identificó como la causa de la muerte rápida del roble en California (“Sudden Oak death” – Quercus spp y Lithocarpus densiflorus) (2002). Entonces la Unión Europea introdujo medidas fitosanitarias para evitar la introducción y extensión en Europa. Actualmente se reconoce como un patógeno que puede afectar al menos a plantas incluidas en 11 familias distintas y 20 especies. Existen algunas otras especies de Phytophthora que pueden compartir características similares, que producen signos en las hojas similares a los provocados por P. ramorum, con hospedador y distribución geográfica similar. Por ejemplo, P. nemorosa se aisla de hojas manchadas y también provoca mortalidad (lethal trunk cankers) pero sin provocar afectación de árboles grandes. P. pseudosyringae se ha considerado que afecta a hojas.

Se requiere una detección rápida y certera para poder tomar las medidas de control adecuadas. Existen varios métodos basados en estudios morfológicos y moleculares- Las características morfológicas dependen del aislamiento del organismo y requiere conocimientos especializados. El aislamiento no es siempre posible ya que dependen de que la muestra sea adecuada y reciente, tipo de material recogido de la planta, y época del año. Así es difícil aislarlo de árboles o de muestras tomadas durante estaciones secas, de la presencia de otros organismos competidores como otras especies de Phytophthora, y además en caso de aislarlo se requieren varios días.

La detección molecular por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) puede permitir detectar organismos no viables, por lo que la tasa de falsos negativos se reduce. Además, la PCR no requiere cultivo. Se han descrito métodos de PCR convencionales y de PCR en tiempo real. También existen métodos inmunológicos mediante ELISA o inmunocromatografías, para reducir la necesidad de realizar métodos moleculares.

Las muestras recomendadas son hojas y tallos, escindidos de la periferia de las lesiones con una hoja de bisturí estéril, lavadas con agua durante 10 segundos y cortadas en piezas muy pequeñas, 5 partes por planta.

   

Métodos de diagnóstico

  • Observación macroscópica visual de lesiones en hojas de las plantas o tubérculos: método tradicional de detección que tiene el inconveniente que no detecta las infecciones asintomáticas, y además puede confundir con las infecciones provocadas por otros agentes que provocan lesiones similares.
  • Examen microscópico de lesiones en hojas de las plantas o tubérculos: método tradicional de detección.
  • Aislamiento en cultivo del hongo: método tradicional de detección, difícil por el escaso crecimiento del micelio fúngico en los medios de cultivo, debido a la microflora acompañante, u otras especies de Phytophthora, además de requerir demasiado tiempo.
  • Detección molecular (PCR): permite detectar la presencia de Phytophthora infestans, con cebadores específicos para la región intergénica ITS u otras secuencias repetitivas, que pueden ser hasta 100 veces más sensibles de detectar.

Pruebas realizadas en IVAMI

  • Detección molecular (PCR), con cebadores específicos para detectar la presencia de Phytophthora ramorum, seguido de secuenciación directa como confirmación.

Muestra recomendada 

 

  • Hojas y tallos, escindidos de la periferia de las lesiones con una hoja de bisturí estéril, lavadas con agua durante 10 segundos y cortadas en piezas muy pequeñas.
  • Para otras muestras, consultar. 

Condiciones de envío

  • Envío refrigerado en sistema isotérmico, que garantice la refrigeración durante todo el transporte.

Plazo de entrega de resultados

  • Las muestras comienzan a procesarse cuando se reciben, y los resultados se emiten en el menor tiempo posible, según los requerimientos técnicos. Para las pruebas de PCR, el plazo habitual de entrega de los resultados es de 48 horas, desde la recepción de la muestra, cuando no se requiere secuenciación, y de 96 horas, cuando se requiere secuenciación.

Coste de la prueba: