Bacillus thuringiensis - Interés como agente para biocontrol de plagas con posibles repercusiones humanas: Cultivo cuantitativo; Identificación molecular (PCR y secuenciación)

Información 30-12-18.

 

Bacillus thuringiensis es una bacteria gram-positiva, anaerobia facultativa, con forma de bacilo, esporulada. Esta especie se caracteriza por producir inclusiones cristalinas parasporales con proteínas tóxicas para larvas de diferentes órdenes de insectos y otros invertebrados. El control biológico de las plagas de insectos por estas proteínas cristalinas insecticidas representa uno de los usos más fructíferos de los agentes de control biológico. Los principales objetivos de los bioinsecticidas basados ​​en B. thuringiensis son las larvas de lepidópteros herbívoros como el gusano de la col u otros, algunos coleópteros, nematodos, ácaros y protozoos. Para este propósito, generalmente se utiliza la cepa B. thuringiensis serotipo kurstaki HD1.

Esta especie de Bacillus, se incluye en el grupo Bacillus cereus. El grupo Bacillus cereus incluye al menos cuatro especies: B. cereus, B. thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides y otras dos especies propuestas Bacillus weihenstephanensis y Bacillus pseudomycoides. La taxonomía del grupo es controvertida, y algunos consideran que la especie Bacillus cereus es una subespecie de B. cereus sensu lato. La identificación y diferenciación de las bacterias del grupo B. cereus es difícil debido a las similitudes genéticas y fenotípicas entre ellas.

Algunas de las especies incluidas en el grupo Bacillus cereus son potencialmente enterotóxicas para humanos y animales, por lo que se requiere detectar rápidamente el grupo B. cereus. B. cereus se encuentra con frecuencia en el suelo y puede aislarse de la leche cruda y los productos lácteos. B. cereus también causa enfermedades transmitidas por los alimentos asociadas con varias toxinas, provocando diarrea en animales superiores. 

B. thuringiensis es difícil de diferenciar por sus características de cultivo y metabólicas de las otras especies del grupo B. cereus cuando pierde un plásmido en el que se encuentra el gen cry que le otorga algunas propiedades.

Para diferenciar los miembros del grupo B. cereus, se han propuesto varias pruebas, incluida la hibridación de ADN de todo el genoma, el análisis de secuencia de los operones 16S-23S, la región espaciadora intergénica gyrB-gyrA, la electroforesis de enzimas, el análisis de electroforesis en gel de campo pulsado, los polimorfismos de longitud de los fragmentos amplificados, factores de virulencia, PCR aleatoria y los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción de los productos de PCR.

En condiciones adversas, Bacillus thuringiensis forma endosporas y, a la vez, inclusiones cristalinas parasporales que contienen una o más proteínas insecticidas como las proteínas Cry y Cyt. Las proteínas Cry son tóxicas por ingestión y su especificidad está determinada por su unión a los receptores en las células epiteliales del intestino medio de los insectos. Los bioplaguicidas comerciales basados ​​en B. thuringiensis se han utilizado durante más de 30 años y las plantas transgénicas que expresan proteínas Cry se han utilizado desde 1996 para el control de plagas de insectos. Algunas cepas de B. thuringiensis también sintetizan otras moléculas insecticidas que se secretan. Se han descrito varios tipos de toxinas secretadas con estructuras y modos de acción muy diferentes. Por ejemplo, Cry1I es una toxina proteica específica de lepidópteros secretada durante la fase estacionaria temprana. La exotoxina beta es otra toxina insecticida extracelular expresada durante el crecimiento vegetativo. Esta toxina es un análogo de nucleótido de adenina y probablemente actúa como un inhibidor de las ARN polimerasas dependientes de ADN. Debido a la toxicidad para los vertebrados, su uso público está prohibido en muchos países. Varias cepas de B. thuringiensis y Bacillus cereus secretan algunas proteínas tóxicas durante su crecimiento vegetativo que no forman cristales y que no tienen homología con las proteínas Cry. Estas proteínas insecticidas vegetativas, llamadas proteínas Vip, son las proteínas insecticidas descubiertas más recientemente de B. thuringiensis y se ha propuesto un sistema para su nomenclatura. Vip1 y Vip2 son proteínas de 100 y 52 kDa, respectivamente, que forman una toxina binaria con actividad contra las larvas de algunas especies de coleópteros. Basándose en su homología con otras toxinas binarias, se ha propuesto que las proteínas Vip1 se unirían a receptores específicos en las células del intestino medio, asociándose como un multímero, que formaría un canal. Vip2 pasaría a través de este poro y, basándose en su homología con las ADP-ribosiltransferasas, modificaría la actina monomérica e inhibiría su polimerización. Vip3 no comparte homología con ninguna otra proteína conocida y se ha demostrado que tiene un amplio espectro insecticida. Esta toxina de 88 kDa se procesa en el intestino medio del insecto hasta una forma activa que es tóxica para varias especies de lepidópteros después de unirse a receptores específicos en las células del intestino medio. Algunas especies de insectos expuestas a una determinada toxina han desarrollado resistencia cruzada a otras toxinas relacionadas, por lo que la identificación de nuevas toxinas podría ser útil para los programas de control en casos de resistencias. De esta forma, se podrían utilizar nuevas toxinas con diferentes modos de acción en las formulaciones de B. thuringiensis y en las plantas transgénicas para evitar el fenómeno de la resistencia cruzada. Las proteínas Vip parecen unirse a sitios diana diferentes a los que se unen las proteínas Cry en las células epiteliales del intestino medio de las especies probadas, por lo que estas proteínas son candidatas para usarse junto con las proteínas Cry en el manejo de plagas de insectos. El uso de esta combinación de toxinas podría aplicarse para ampliar el espectro de toxicidad y minimizar el riesgo de resistencia cruzada. La detección de los genes vip2 y vip3 en las cepas de B. thuringiensis se ha realizado utilizando métodos basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los productos de amplificación de las reacciones de PCR confirman la presencia de genes vip, pero este enfoque solo permite la asignación del gen a una familia vip (vip1, vip2 o vip3) y no permite la identificación de genes específicos dentro de una familia.

Debido a las similitudes genéticas entre B. thuringiensis y B. cereus, que podrían causar enfermedades gastrointestinales e infecciones somáticas, la seguridad de B. thuringiensis como bioinsecticida ha sido cuestionada, aunque solo existen algunas informaciones de casos clínicos relacionados con el uso de B. thuringiensis. Sin embargo, ni la práctica médica ni los métodos utilizados para la detección de patógenos alimentarios discriminan entre B. thuringiensis y B. cereus como agentes causales en relación con la contaminación de alimentos o enfermedades humanas, por lo que se desconoce la proporción real de la participación de B. thuringiensis en estas enfermedades, que se atribuyen en general a B. cereus. Existe un estudio en el que se ha demostrado que B. thuringiensis está involucrado en un brote de gastroenteritis en cuatro personas. En este estudio, la cepa se identificó inicialmente como B. cereus, pero luego se descubrió que era B. thuringiensis.

Solo se han realizado algunos intentos para aislar B. thuringiensis de diferentes tipos de alimentos, y ninguno de ellos ha incluido su cuantificación. B. thuringiensis se ha recuperado de una amplia variedad de alimentos, como pasta, arroz, especias, granos, pan, legumbres y leche. Los aislados obtenidos pertenecían al serotipo kurstaki o neoleonensis. B. thuringiensis kurstaki se aisló de uvas para consumo humano y se planteó la hipótesis de que la bacteria podría haberse originado a partir de residuos de bioplaguicidas.

Pruebas realizadas en IVAMI:

  • Cultivo en medios semi-selectivos para bacterias del grupo Bacillus cereus entre las que se encuentra Bacillus thuringiensis.
  • Detección molecular (PCR) de genes cry, específicos de Bacillus thuringiensis.

Muestra recomendada:

 

  • Producto vegetal.
  • Productos derivados de vegetales.
  • Productos de origen animal que pudiesen contener esta bacteria.

Conservación y envío de la muestra:

  • Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
  • Congelada: más de 2 días.

 

Plazo de entrega de resultados:

 

  • Cultivo e identificación molecular: 5 a 10 días. 

Coste de la prueba:  

  • Cultivo en medios semiselectivos (parcialmente discriminadores): Consultar a ivami@ivami.com