Biocontrol bacteriano - Pruebas para hongos fitopatógenos: Ensayo de enfrentamiento en placa (Plate Confrontation Assay).

Existen varias bacterias beneficiosas para las plantas protegiéndolas de enfermedades, como ocurre con los microorganismos rizosféricos o endofíticos, entre las que se encuentran especies de Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas y Burkholderia. Las enfermedades de plantas causadas por hongos son uno de los factores limitantes de la producción de los cultivos, al provocar pérdidas considerables cuando afectan a su rendimiento o cuando reducen la calidad de la cosecha, como ocurre con la acumulación de niveles elevados de micotoxinas, que los hacen inseguros para el consumo humano o animal. El manejo integral de las enfermedades de las plantas, incluyendo los métodos de cultivo, los métodos físicos, químicos y biológicos son las recomendaciones más frecuentes para suprimir las enfermedades de plantas. Sin embargo, con frecuencia son los métodos químicos (fungicidas) los preferidos por su rapidez y acción específica. Sin embargo, el uso extensivo e indiscriminado de productos químicos en los sistemas agrícolas está generando preocupaciones ambientales y de salud. La aplicación frecuente e intensiva de productos químicos también ha dado lugar al desarrollo de resistencia a los fungicidas en muchos fitopatógenos. En cuanto a la relación con la salud se considera que pueden afectar al desarrollo, defectos reproductivos o incluso cáncer.

Por ello, el control biológico de las enfermedades de las plantas adquiere cada vez más importancia, ya que es ecológicamente sostenible y ambientalmente seguro. La mayoría de los agentes de biocontrol (BCA: Biocontrol agents) utilizados para la supresión de enfermedades de las plantas son antagonistas microbianos. Entre los BCA, los antagonistas bacterianos son los más utilizados y estudiados. Las bacterias antagonistas asociadas a las plantas tienen diferentes mecanismos para actuar frente a los fitopatógenos, como pueden ser la competencia por los nutrientes, la producción de metabolitos antimicrobianos como son los antibióticos y los lipopéptidos, y la emisión de compuestos orgánicos volátiles (VOC), como cetonas y compuestos de azufre que pueden inducir respuestas de defensa de las plantas y/o antagonizar a los hongos fitopatógenos.

Estos agentes de biocontrol microbianos representan una alternativa segura al uso intensivo de agroquímicos, residen en estrecha asociación con las superficies de las plantas, es decir, hojas o raíces, y protegen a la planta de los fitopatógenos al preparar la respuesta de defensa de la planta, competir por nutrientes y/o antagonizar directamente el crecimiento y desarrollo de los patógenos.

Algunas especies de bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia y Streptomyces tienen la capacidad de actuar frente a los hongos fitopatógenos, y también pueden producir metabolitos bioactivos, siendo Bacillus spp. los más importantes como agentes de biocontrol debido a su ubicuidad, adaptabilidad y la formación de endosporas.

La valoración de los agentes de biocontrol (BCA) es importante, debiendo realizarse de la forma más completa posible ya que si no se realiza correctamente puede conllevar el fracaso de la eficacia del producto durante su uso real.

Las pruebas antagónicas clásicas, que se conocen como cultivos duales, confrontación de placas o ensayos de zona de inhibición, evalúan la afectación de los microorganismos candidatos a ser agentes de biocontrol frente a un hongo fitopatógeno mediante la coinoculación en medios de cultivo sólidos o en medios de cultivo líquidos.

El ensayo de enfrentamiento en placa de medio de agar sólido para demostrar la inhibición del desarrollo del micelio es el método de detección in vitro más utilizado para la selección preliminar de los microorganismos utilizados para el biocontrol. Se ha demostrado que existe una correlación elevada con los ensayos en plantas. No obstante, existen distintas formas de realización por lo que a veces los resultados obtenidos en distintas evaluaciones no son comparables.

Por otra parte, debe tenerse en cuenta que aunque el efecto inhibidor de bacterias específicas esté bien documentado, a veces no se realizan ensayos para identificar agentes de biocontrol realmente competentes, por lo que muchos agentes de biocontrol potenciales finalmente no logran suprimir las enfermedades de las plantas en los ensayos de campo.

Existen métodos que tienen en cuenta numerosos factores, incluyendo la competencia por nutrientes o espacio, los componentes de la superficie celular y la secreción inducida o constitutiva de metabolitos volátiles o solubles. Otros ensayos antagónicos evalúan el efecto de componentes inhibidores individuales, como volátiles, policétidos, lipopéptidos, sideróforos y enzimas líticas, incluidas las quitinasas, glucanasas y proteasas, en el crecimiento de los fitopatógenos.

En IVAMI realizamos la prueba de enfrentamiento en placa de agar sólido. La prueba se realiza por triplicado para las placas en las que se disponen la bacteria (o el producto que la contiene) y el hongo fitopatógeno elegido, y también para las placas de control, únicamente inoculadas con el hongo fitopatógeno. La bacteria (o el producto que la contiene) se utilizan a varias concentraciones, habitualmente 5, a menos que se elijan más concentraciones por el cliente, ya que la inhibición puede depender y variar los resultados obtenidos según la cantidad de bacterias utilizadas. En un ensayo básico se realizan 15 cultivos de enfrentamiento, más 3 cultivos de control de crecimiento fúngico. La lectura de los resultados se realiza cada 24 horas durante 5 ó 7 días de incubación, según la rapidez de desarrollo del hongo fitopatógeno. En cada lectura de resultados y en cada placa se realiza la medida de los radios de crecimiento fúngico en dos direcciones y la medida de las zonas de inhibición entre la bacteria y el crecimiento fúngico. Con los valores obtenidos, se calculan los índices de inhibición. Al final de la prueba se realiza la observación microscópica de los bordes del crecimiento fúngico para conocer si existen alternaciones morfológicas de sus hifas.