Photobacterium damselae subsp. piscicida y Photobacterium damselae subsp. damselae:

agentes de Pasteurelosis (fotobacteriosis) de peces - Diagnóstico molecular (PCR y secuenciación)

 

Información 16-09-18.

    Las especies de Photobacterium damselae son uno de los patógenos bacterianos más devastadores en la acuicultura marina en todo el mundo y algunas de ellas son patógenas para animales marinos y humanos. Estas especies son los agentes causales de fotobacteriosis (anteriormente conocida como pasteurelosis) una de las enfermedades bacterianas que más afectan tanto a las especies marinas salvajes como a las especies cultivadas en Europa, Japón y la región Mediterránea.

Photobacterium damselae y su repercusión en la acuicultura 

P. damselae es una bacteria Gram negativa que incluye dos subespecies P. damselae subsp. damselae y P. damselae subsp. piscicida. Ambas subespecies incluyen las especies antiguamente denominadas Vibrio damsela y Pasteurella piscicida, respectivamente, y que por lo tanto se clasificaban dentro de dos familias diferentes Vibrionaceae y Pasteurellaceae, aspecto que concordaba con el amplio rango de diferencias fenotípicas existentes entre ambas. Sin embargo, estudios realizados a partir de la secuenciación del gen del ARN ribosómico 16S y ensayos de hibridación DNADNA demostraron que Vibrio damsela y Pasteurella piscicida eran miembros de una única especie.

Photobacterium damselae subsp. piscicida 

La pasteurelosis o fotobacteriosis es causada por P. damselae subsp. piscicida, y es una de las enfermedades de etiología bacteriana con mayor repercusión económica en los cultivos de peces marinos a nivel mundial. Probablemente, es la patología más devastadora en la producción de pargo (Pagrus pagrus) en el área del mediterráneo. Esta enfermedad también es conocida como pseudotuberculosis, debido a que los peces enfermos de forma crónica presentan gránulos blancos prominentes en órganos internos como bazo, riñón o hígado. Otros signos externos de esta enfermedad son un ligero oscurecimiento de la piel y distensión abdominal acompañada a veces de áreas hemorrágicas en cabeza y branquias.

La pasteurelosis parece ser una enfermedad de mayor prevalencia en los meses de verano donde la temperatura del agua es más elevada (mayor de 23ºC). P. damselae subsp. piscicida sobrevive en estado viable en el agua durante 4 o 5 días, y es capaz de entrar en un estado viable no cultivable de al menos un mes, utilizando los sedimentos marinos y el agua de mar como reservorio y vehículo de transmisión. Los hospedadores de P. damselae subsp. piscicida incluyen diferentes especies de peces marinos, tanto salvajes como de cultivo.

La enfermedad fue inicialmente descrita en 1963 en poblaciones salvajes de perca blanca (Morone americanus) y en menor grado en las de lubina americana (Morone saxatilis) en una epizootia en Chesapeake Bay (Maryland, USA). Desde 1969 la pasteurelosis ha sido una de las enfermedades más importante de peces en Japón, afectando principalmente a seriola (Seriola quinqueradiata), aunque también afecta a otras especies como el mero de pintas rojas (Epinephelus akaara) y a una especie de blenio (Pictiblennius yatabei). Desde 1990 ha causado grandes pérdidas económicas en cultivos de dorada (Sparus aurata), lubina (Dicentrarchus labrax) y lenguado (Solea senegalensis y Solea solea) en países europeos del área mediterránea y también en perca (Morone americanus) en Estados Unidos. Recientemente se ha aislado de cobia (Rachycentron canadum) y pez del paraíso (Macropodus opercularis) en Taiwán y también de salmonete (Mullus spp.) en Italia.

Photobacterium damselae subsp. damselae 

En 1981, P. damselae subsp. damselae fue aislado a partir de úlceras en la piel del pez ángel (Chromis punctipinnis). Se puede aislar P. damselae subsp. damselae de diferentes ecosistemas acuáticos, ya que este organismo es capaz de sobrevivir en agua de mar y sedimentos durante largos períodos de tiempo. Además, es capaz de transmitirse a través del agua, siendo responsable de causar procesos patológicos en diversas especies marinas. Normalmente los brotes infecciosos producidos por P. damselae subsp. damselae siguen una distribución estacional, coincidiendo con temperaturas del agua más templadas y una disminución en la resistencia del organismo hospedador debida a cambios fisiológicos durante su madurez sexual. Además, el incremento de la temperatura media del agua del mar, que está ocurriendo de manera generalizada durante estas últimas décadas como consecuencia del calentamiento global, posiblemente provocará un aumento en el número de infecciones producidas por este organismo.

Los signos externos más destacables que causa P. damselae subsp. damselae en peces son: distensión abdominal, presencia de áreas hemorrágicas alrededor de ojos, boca y ano y en ocasiones úlceras cutáneas. Estos signos son similares a los producidos por Yersinia ruckeri en salmónidos. Internamente se observa una acumulación de fluido hemorrágico dentro de la cavidad peritoneal.

Los hospedadores de P. damselae subsp. damselae incluyen diferentes especies de animales marinos, tanto salvajes como de cultivo. P. damselae subsp. damselae es patógeno para reptiles como la tortuga laúd (Dermochelys coriacea), moluscos como el pulpo (Octopus joubini), crustáceos como el camarón (Penaeus monodon); mamíferos como el delfín (Tursiops truncatus, Delphinus delphis) o la ballena (Balaenoptera edeni), peces salvajes como el tiburón (Carcharhinus plumbeus, Squalus acanthias), pez ángel (Chromis punctipinnis), medregal del Japón (Seriola quinqueradiata) o raya (Dasiatis pastinaca). Pero también es patógeno de peces de interés económico como el rodaballo (Psetta maxima), trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), la palometa blanca (Trachinotus ovatus), una especie de lenguado (Cynoglossus semilaevis) o la perca gigante (Lates calcarifer) muy utilizados para acuicultura en China y Tailandia, respectivamente.

En el área mediterránea, el cultivo intensivo de nuevas especies ha provocado varios brotes con mortalidad moderada en los que se ha visto involucrado P. damselae subsp. damselae. Entre las especies afectadas se encuentran: dentón común (Dentex dentex), pargo sémola (Pagrus auriga), sargo común (Diplodus sargus), dorada (Sparus aurata) y en menor medida lubina (Dicentrarchus labrax).

P. damselae subsp. damselae no solo afecta a especies poiquilotermas, sino que debido a su capacidad de crecimiento a 37ºC, es potencialmente patógena para animales homeotermos, e incluso el hombre. Este organismo fue aislado por primera vez como agente causal de un caso infeccioso registrado en seres humanos en 1971. En el hombre, causa desde infecciones ulcerosas externas hasta septicemias generalizadas que pueden llevar a la muerte del individuo, por lo que su importancia en clínica humana ya ha sido reconocida. Normalmente la infección deriva de lesiones cutáneas superficiales producidas durante la manipulación de peces marinos infectados, o a través de heridas externas que entran en contacto con el agua de mar. Aunque se han detectado casos en pacientes completamente sanos, gran parte de los cuadros clínicos causados por P. damselae subsp. damselae tienen lugar en pacientes que presentan algún tipo de enfermedad de base como diabetes, cirrosis o afecciones cardiacas. 

Photobacterium damselae: Posición taxonómica 

La pasteurelosis es una enfermedad conocida desde hace muchos años. Sin embargo, la posición taxonómica de su agente causal ha sido objeto de constante controversia. En 1964 Snieszko et al. situaron este microorganismo dentro del género Pasteurella por sus características morfológicas y bioquímicas, a pesar de la incapacidad del organismo para reducir nitratos, ser la única bacteria marina perteneciente a este género y presentar una tolerancia a unos valores de pH y temperatura inusuales para los miembros del género Pasteurella. Más tarde en 1968, Janssen y Surgalla al realizar nuevos ensayos, hallaron suficientes diferencias en las características fisiológicas y serológicas con relación a especies del mismo género como para proponer una nueva especie denominada Pasteurella piscicida.

Estudios filogenéticos posteriores confirmaron la relación de Pasteurella piscicida con la familia Vibrionaceae y la asociación de este organismo con Photobacterium damselae. Así, se determinó que las secuencias del gen del ARNr 16S de Pasteurella piscicida y Photobacterium damselae difieren sólo en un nucleótido de las 1.434 posiciones secuenciadas. Al realizar análisis de hibridación DNA-DNA, se llegó a la conclusión de que Pasteurella piscicida y Photobacterium damsela eran miembros de la misma especie.

Características morfológicas, bioquímicas y serológicas

Photobacterium damselae subsp. piscicida 

P. damselae subsp. piscicida es un bacilo (0,8-1,3 x 1,4-4 µm) Gram negativo, inmóvil, oxidasa y catalasa positivo, fermentativo y anaerobio facultativo. Negativo para las reacciones de indol, ureasa, gelatinasa, amilasa y citrato, no produce gas a partir de glucosa y es incapaz de reducir nitratos. Presenta una tinción bipolar característica y puede mostrar pleomorfismo, variando su forma según las condiciones de cultivo o la fase de crecimiento, ya que crecen formando cadenas, son más largos y muestran una forma más bacilar que en fases más tardías donde su forma se asemeja más a cocobacilos. Presenta actividades lipasa y fosfolipasa, pero carece de actividad  β-hemolítica, aunque ha sido descrita recientemente una fosfolipasa con actividad hemolítica frente a eritrocitos de diferentes peces.

Tiene un carácter halófilo obligado, mostrando un buen crecimiento en medios con una concentración de NaCl del 1,5-2%. Este crecimiento se inhibe completamente a concentraciones de NaCl por encima del 5%. No presenta bioluminiscencia y es capaz de producir material capsular con un 96% de carbohidrato y un 0,4% de proteína. Presenta un estrecho rango de temperaturas entre los 15 y 30ºC a las cuales es capaz de crecer, aunque su óptimo de crecimiento se sitúa en torno a los 25 ºC.

Estudios serológicos con células totales y el antígeno O somático, demuestran que no se pueden establecer diferentes serogrupos dentro de P. damselae subsp. piscicida, hecho corroborado al estudiar los patrones de lipopolisacáridos y las proteínas de membrana externa. Los ensayos de inmunoblot demuestran un alto nivel de similitud antigénica entre las cepas, ya que todos los lipopolisacáridos poseen una reacción similar. Por otra parte, el análisis del contenido plasmídico de varias cepas de P. damselae subsp. piscicida procedentes de Japón, USA y Europa muestran un patrón similar entre las cepas de Estados Unidos y Europa, pero éste difiere bastante del mostrado por las cepas de procedencia Japonesa.

Photobacterium damselae subsp. damselae 

P. damselae subsp. damselae es un bacilo Gram negativo, móvil mediante flagelos polares monotricos con cierto pleomorfismo. Posee catalasa y arginina dehidrolasa, fermenta la glucosa con producción de gas, la manosa y maltosa, produce ureasa, lipasa, amilasa, quitinasa, fosfolipasa, condroitinasa, hialuronidasa y hemólisis, aunque no todas las cepas presentan los mismos valores, e incluso algunas carecen de tales actividades.

Muestra requerimientos estrictos de NaCl, tolerando concentraciones que alcanzan el 5%. A diferencia de P. damselae subsp. piscicida, presenta unos rangos de temperatura de crecimiento amplios, desde 12ºC a 37ºC. El análisis del contenido en lipopolisacáridos mostró la existencia de una enorme variabilidad de perfiles de lipopolisacáridos. Este resultado se correlaciona con el obtenido en los ensayos serológicos, donde se encontró la existencia de cuatro serogrupos diferentes.

Caracterización molecular de Photobacterium damselae

La prueba de PCR es muy útil para el diagnóstico rápido y confirmatorio de la presencia de P. damselae. La detección específica de ambas subespecies de P. damselae se lleva a cabo utilizando la prueba de PCR convencional, con primers correspondientes al gen codificante del polisacárido capsular presente en las dos subespecies P. damselae.

Por otro lado, los genes UreC son actualmente el único ensayo de PCR que puede realizarse con éxito para discriminar entre las subespecies de P. damselae puesto que P. damselae subsp. damselae posee el gen UreC, incluido en el operón Ure y P. damselae subsp. piscicida carece de este gen, lo que concuerda con su fenotipo ureasa negativo.

Pruebas realizadas en IVAMI:

  • Detección molecular de la especie Photobacterium damselae subsp. piscicida y subsp. damselae mediante amplificación del fragmento interno del gen del polisacárido y mediante amplificación del gen ureC. 

Muestra recomendada:

  • Bazo, riñón y sangre de peces y muestras de hepatopáncreas de moluscos y crustáceos.

Conservación y envío de la muestra:

  • Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días, o congelada si el periodo de conservación es superior.

Plazo de entrega de resultados:

  • Detección molecular del ADN de la especie Photobacterium damselae subsp. piscicida y subsp. damselae
  • Identificación molecular de la Photobacterium damselaesubsp. damselae mediante amplificación de la región codificante del gen del gen ureC: 24 a 48 horas.

Coste de la prueba:  

  • Diagnóstico molecular (PCR) de las especies Photobacterium damselae subsp. piscicida y Photobacterium damselaesubsp. damselae: Consultar a ivami@ivami.com